Influenza-A-Virus reguliert die Interferon-Signalübertragung und die damit verbundenen Gene; MxA und STAT3 durch zelluläres miR

Virology Journal Band 20, Artikelnummer: 183 (2023) Diesen Artikel zitieren

326 Zugriffe

2 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Die antivirale Reaktion gegen eine Infektion mit dem Influenza-A-Virus (IAV) umfasst die Induktion des Interferon (IFN)-Signalwegs, einschließlich der Aktivierung der STATs-Proteinfamilie. Anschließend steuern das antivirale Myxovirus-Resistenzprotein (MxA) und andere Interferon-stimulierte Gene die Virusreplikation. Die molekulare Interaktion der viral vermittelten IFN-Signalisierung bedarf jedoch weiterer Untersuchungen. Wirts-microRNAs (miRNAs) sind kleine nichtkodierende Moleküle, die die Genexpression posttranskriptionell regulieren. Hier wollten wir die mögliche Beteiligung von miR-141 an der IAV-vermittelten IFN-Signalisierung untersuchen. Dementsprechend wurde die Microarray-Analyse von A549-Zellen, die mit dem Vorläufer miR-141 (Prä-miR-141) transfiziert waren, verwendet, um die potenziell regulierten Gene als Reaktion auf die Überexpression von miR-141 unabhängig von einer IAV-Infektion zu erfassen. Die Herunterregulierung gezielter Gene durch miR-141 zusätzlich zur viralen Genexpression wurde durch quantitative Echtzeit-PCR, Western-Blot-Analyse und durchflusszytometrische Tests untersucht. Unsere Ergebnisse zeigten eine signifikante Hochregulierung von miR-141 in infizierten A549-Zellen mit verschiedenen IAV-Stämmen. Bemerkenswert ist, dass die IAV-Replikation in mit dem miR-141-Inhibitor transfizierten Zellen stark unterbrochen war. Während seine Replikation in mit prä-miR-141 transfizierten Zellen deutlich zunahm, bestätigt dies die entscheidende Rolle von miRNA-141 bei der Unterstützung der Virusreplikation. Interessanterweise zeigten die Microarray-Daten von miR-141-transduzierten A549-Zellen viele herunterregulierte Gene, darunter MxA, STAT3, IFI27 und LAMP3. Das Expressionsprofil von MxA und STAT3 war in infizierten Zellen, die mit dem Prä-miR-141-Inhibitor transfiziert wurden, deutlich erschöpft, während ihre Expression in infizierten Zellen, die mit dem miR-141-Inhibitor transfiziert waren, wiederhergestellt wurde. Im Gegensatz zu Interleukin 6 (IL-6) nahm die Produktion von IFN-β in infizierten Zellen, die mit Prä-miR-141 transfiziert wurden, deutlich ab, während sie in infizierten Zellen, die mit miR-141-Inhibitor transfiziert wurden, deutlich anstieg. Diese Daten belegen die entscheidende Rolle von miR-141 bei der Regulierung der durch IFN- und IL-6-Signale induzierten antiviralen Genexpression während einer IAV-Infektion, um die Virusreplikation sicherzustellen.

Aufgrund der schwerwiegenden Komplikationen während der Infektion stellt die Grippe für die Menschheit eine anhaltende Bedrohung dar und verursacht jedes Jahr saisonale Atemwegsepidemien [1]. Das Influenza-A-Virus (IAV) gehört zur Familie der Orthomyxoviridae und wird anhand von zwei Hauptproteinen in der Virushülle in viele Subtypen eingeteilt; Hämagglutinin und Neuraminidase. Trotz des breiten Spektrums möglicher Subtypen existierten nur drei kontinuierlich und lösten Pandemien aus, wie die H1N1-Stämme in den Jahren 1918 und 2009 sowie H2N2 im Jahr 1957 und H3N2 im Jahr 1968 [2]. Im Jahr 1918 galt die pandemische Influenza-Infektion als ernsthafte Bedrohung für die Atemwege Da das pandemische H1N1-Virus weltweit schätzungsweise 50 Millionen Menschen tötete und als „Spanische Grippe“ bekannt ist, verlor es nach der Impfung seine tödliche Wirkung und wurde zu einer leicht heilbaren Infektion [3]. In den letzten Jahren, genau Ende 2019, war die Welt mit einem weiteren schwerwiegenden Atemwegserreger konfrontiert, dem schweren akuten respiratorischen Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), das zu 6,3 Millionen Todesfällen führte (Weltgesundheitsorganisation). Leider fördern saisonale Influenza-A-Viren (IAV) die Infektiosität von SARS-CoV-2 [4]. Im Wesentlichen besteht das IAV-Genom aus negativen, achtsegmentierten; Spüren Sie einzelsträngige RNA, die dicht im Viruskern gepackt ist. Die drei größten Segmente des viralen Genoms kodieren die drei viralen Proteinuntereinheiten viraler RNA-abhängiger RNA-Polymerasen (PB1, PB2 und PA), die für die RNA-Synthese und -Replikation auf Wirtszellen erforderlich sind. Zwei RNA-Segmente kodieren für die viralen Glykoproteine Hämagglutinin, das die Bindung an Sialinsäure-haltige Rezeptoren vermittelt, die den Viruseintritt erleichtern, und Neuraminidase (NA), die für die Freisetzung von Virusnachkommen ausgegeben wird [5]. Das RNA-Segment 5 kodiert für virales Nukleoprotein (NP), das die segmentierte RNA bindet und schützt. Die RNA-Segmente 6 und 8 kodieren für mehr als ein Protein, das sogenannte Matrixprotein (M1) und Membranprotein (M2) sowie das Nichtstrukturprotein NS1 (Nichtstruktur) und Kernexportprotein (NEP). Bemerkenswert ist, dass das NS1-Protein ein entscheidender Faktor ist, der die antivirale Abwehr des Wirts in infizierten Zellen schwächt. Das Influenzavirus kodiert auch für andere virale Helferproteine in infizierten Zellen, wie PB1–F2 und PA-x, die erforderlich sind, um angeborene antivirale Reaktionen des Wirts mit dem NS1-Protein zu verhindern. NS1, NEP, PB1–F2 und PA-x sind im Viruspartikel vorhanden, jedoch in minimalen Mengen [6, 7].

Wichtig ist, dass microRNAs (miRNAs) kleine, nicht-kodierende RNA-Moleküle sind, die die Genexpression ihrer Ziel-mRNA posttranskriptionell regulieren, um letztendlich Immunantworten abzustimmen [8, 9]. Diese kleinen Sequenzen (20–25 Nukleotide) werden durch die RNA-Polymerase II in Form von langer Haarnadel-Primär-RNA (pri-miRNA) transkribiert [10]. MicroRNAs spielen eine Schlüsselrolle bei vielen biologischen Prozessen, einschließlich Zellproliferation, Zelldifferenzierung, Zelltod, Hämatopoese und Strukturierung des Nervensystems [11]. In Säugetierzellen werden miRNAs bei mehreren Virusinfektionen hochreguliert, um verschiedene zelluläre Prozesse zu modulieren [12]. Zelluläre miRNAs können die Virusreplikation verstärken, wie beispielsweise leberspezifisches miR-122, das sich als essentiell für die Proliferation des Hepatitis-C-Virus (HCV) erwiesen hat. Zelluläres miR-122 interagiert direkt mit einem spezifischen Teil des HCV-Genoms, 5´UTR, der überlappende cis-wirkende Signale enthält, die an der Translation und RNA-Synthese beteiligt sind und die Expression viraler Komponenten fördern [13]. Interessanterweise führt die Täuschung von miR-122 mithilfe von Antisense-Oligonukleotiden zu einer dramatischen Hemmung der HCV-Reproduktion in menschlichen Leberzellkulturen, was darauf hindeutet, dass der Antagonismus von miR-122 eine neuartige Therapiestrategie gegen HCV darstellen könnte [14]. Es gibt Hinweise darauf, dass die miR-122-Expression in menschlichen Leberzellen, die mit IFN-β behandelt wurden, deutlich reduziert ist, was eine unbekannte Funktion von IFN-β zur Bekämpfung von HCV-Infektionen darstellt [15].

Insbesondere während einer IAV-Infektion täuscht das Virus die zellulären Prozesse des Wirts, um sich zu replizieren. Einerseits hemmt das Influenzavirus die Synthese von Wirtsproteinen, erleichtert die Expression seiner eigenen Proteine und korreliert häufig die Pathogenität mit der Wachstumsrate [16]. Andererseits induzierten die infizierten Zellen auch verschiedene Wege, um die Replikation des Influenzavirus über eine Reihe komplexer Signalwege zu hemmen, darunter PRR-abhängige Signalwege und die molekularen Kaskaden des RNA-Helicase-Retinsäure-induzierbaren Gens I (RIG- I, MDA5, TRAF3, IKK, TBK1), die die Produktion von Interferon (IFN) und Entzündungsfaktoren sowie die Expression antiviraler IFN-stimulierter Gene (ISGs) induzieren können [17, 18]. Diese Proteine hemmen nicht nur die Virusreplikation in infizierten Zellen, sondern stimulieren auch die von T- und B-Zellen vermittelte Immunantwort, indem sie dendritische Zellen (DCs) und Makrophagen aus virusinfizierten Geweben rekrutieren [19]. Das wichtigste antivirale Programm wird durch Typ-I-Interferon kontrolliert, einschließlich IFN-α und IFN-β, die mehrere Ebenen einschränken. Mehrere Studien berichteten, dass eine Infektion mit IAV die Bildung zytoplasmatischer Vakuolen, nämlich Autophagie, induziert, bei der sich virale RNA-Replikationskomplexe ansammeln und die Virusreplikation stimulieren [20,21,22]. Die mit der Autophagie in Zusammenhang stehende Atg-Familie, wie Atg5, Atg8 (Mikrotubuli-assoziierte Protein-1-Leichtkette 3, LC3) und Atg12, kolokalisierte mit solchen Vakuolen und viralen RNA-Replikationskomplexen [23, 24]. Darüber hinaus wird die Aktivierung der Autophagie durch die Konjugation zwischen Atg5-Atg12 initiiert. Eine solche Konjugation reguliert negativ den IFN-β-Weg, der bei einer IAV-Infektion durch direkte Assoziation mit RIG-I und IFN-β-Promotorstimulation 1 (IPS-1) stimuliert wird (25).

Auf diese Weise wollten wir untersuchen, ob miR-141 in menschlichen Lungenepithelzellen (A549-Zellen) als Reaktion auf eine IAV-Infektion hochreguliert wird und ob miR-141 möglicherweise an der durch IAV regulierten zellulären Immunantwort beteiligt ist, die durch eine Infektion stimuliert wird.

Menschliche Lungenkarzinom-Epithelzellen A549-Zelllinien aus (VACSERA, Gizeh, Ägypten) und MDCK-Zelllinien (Madin-Darby-Hundeniere) wurden im Roswell Park Memorial Institute 1640-Medium (RPMI) vermehrt, das 25 mM HEPS und 4 mM L enthielt -Glutamin und 10 % hitzeinaktiviertes Rinderserumalbumin (BSA) und inkubiert bei 37 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 95 %. Zelllinien wurden regelmäßig auf Mykoplasmenkontamination überprüft [26].

Um das Influenzavirus zu reproduzieren, wurden IAV A/WSN/33, A/PR/8/34 und A/PDM/08 in die Allantoismembran von embryonierten Hühnereiern (10 Tage alte Eier) injiziert, und dann wurden die infizierten Embryonen infiziert inkubiert, um das Viruswachstum zu ermöglichen. Aus den infizierten Eiern wurden dann hohe Virustiter nachgewiesen [27].

A549-Zellen wurden in einer Platte mit 6 Vertiefungen mit einer Dichte von 10 × 104 Zellen/Vertiefung ausgesät und über Nacht bei 37 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 95 % inkubiert. Vor der Infektion wurden die alten Medien verworfen und die Zellen mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) gewaschen; Anschließend wurden die Zellen mit unterschiedlicher MOI (Infektionsmultiplizität) von IAV, einschließlich 0,05, 0,1, 0,25, 0,5 und MOI von 1, eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Verwendung von PBS, ergänzt mit 0,1 % BSA, infiziert. Das infektiöse Medium wurde verworfen und jeder Vertiefung wurden 2 ml vollständiges RPMI-Medium zugesetzt. Anschließend wurden die infizierten Zellen 24 Stunden lang inkubiert [20]. Um die Wirksamkeit von IFN-β auf die Virusreplikation zu untersuchen, wurden A549-Zellen in Platten mit 6 Vertiefungen gezüchtet. Die Zellen wurden dann 2 Stunden vor der Virusinfektion und kontinuierlich während der Infektion IFN-β (5 IE/ml) ausgesetzt, wann immer es nötig war. Nicht infizierte und infizierte Zellen wurden ohne IFN-β belassen, um als Kontrollen zu dienen.

A549-Zellen wurden in einem vollständigen RPMI-Medium gezüchtet und über Nacht in Platten mit 6 Vertiefungen mit einer Konfluenz von etwa 80 % kultiviert. A549-Zellen wurden dann entweder mit einem entsprechenden Inhibitorantagonisten miR-141 (5-'ACAACCACTGTCTGGTAAAG-3′) oder pre-miR-141 unter Verwendung von Lipofectamine LTX (Invitrogen, USA) transfiziert. Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurden die Zellen mit 12,5 µg/ml unter Verwendung von 20 µl Lipofectamine LTX, zubereitet in 500 µl optimalem Medium, transfiziert. Mit der gleichen Konzentration an Transfektionsreagenzien transfizierte Zellen wurden wie kontrolltransfizierte Zellen abgetrennt. Transfizierte Zellen wurden zwei Tage lang inkubiert und dann mit IAV (MOI von 1) infiziert. Die Knockdown-Effizienz von miR-141 und die relative Expression der angegebenen Gene wurden in transfizierten und infizierten Zellen mittels qRT-PCR überwacht. Der Durchflusszytometrie-Assay wurde verwendet, um die kinetische Proteinexpression von MxA und STAT3 in transfizierten und infizierten Zellen nachzuweisen [24].

Für den Proliferationsassay transfizierter A549-Zellen mit entweder miR-141-Inhibitor oder Vorläufer wurden die Zellen doppelt in einer Platte mit 6 Vertiefungen mit 10 × 104 Zellen pro Vertiefung kultiviert. Die Zellmorphologie wurde mit dem Umkehrmikroskop überwacht. Die Anzahl der nach der Transfektion überlebenden Zellen wurde mithilfe eines Hämozytometers ermittelt. Kurz gesagt, die alten Medien wurden verworfen und die Zellen wurden zweimal mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, bevor sie durch 3-minütige Inkubation bei 37 °C trypsiniert wurden. Dann wurde den trypsinisierten Zellen ein geeignetes Volumen kompletter RPMI-Medien zugesetzt und die Anzahl der Zellen manuell erfasst [28, 29]. Um die Zytotoxizität der miR-141-Transfektion zu untersuchen, wurden A549-Zellen dreifach in 96-Well-Platten mit 10 × 103 Zellen pro Well ausgesät und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von pre-miR-141 oder spezifischem Inhibitor (12,5–200 µg/Well) transfiziert. Mit Transfektionsreagenzien behandelte Zellen dienten als kontrolltransfizierte Zellen. Die Lebensfähigkeitsrate der Zellen wurde mithilfe des kolorimetrischen MTT-Assay-Kits (Sigma-Aldrich, Deutschland) überwacht. Kurz gesagt, das Kulturmedium wurde verworfen und PBS wurde zum Waschen der Zellen verwendet; Anschließend wurden jeder Vertiefung 100 µl RPMI-Medium zugesetzt. Als nächstes wurden 10 µl MTT-Lösung zugegeben und die Platte 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Schließlich wurden 100 µl SDS-HCl in jede Vertiefung der Platte gegeben, die dann 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert wurde. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde in Abhängigkeit von der Menge an umgewandeltem wasserlöslichem MTT in ein unlösliches Formazan überwacht, das dann solubilisiert und durch die optische Dichte bei 570 nm bestimmt wurde.

Zur Genexpressionsprofilierung transfizierter Zellen wurde die Gesamt-RNA mit der TRIzol-Reagenz-RNA-Herstellungsmethode (Invitrogen) unter Verwendung von Glykogen als Träger isoliert. Die Qualitätskontrolle und Quantifizierung der Gesamt-RNA-Menge wurden mit einem Agilent 2100-Bioanalysator (Agilent Technologies) und einem NanoDrop 1000-Spektrophotometer (Kisker) bewertet. Kurz gesagt, mRNA wurde unter Verwendung eines Oligo-dT-T7-Promotor-Primers revers transkribiert und amplifiziert und die resultierende cRNA wurde entweder mit Cyanin 3-CTP oder Cyanin 5-CTP markiert. Nach der Fällung, Reinigung und Quantifizierung wurden 1,25 µg jeder markierten cRNA fragmentiert und gemäß dem Protokoll des Lieferanten (Agilent Technologies) mit Mikroarrays für das gesamte menschliche Genom hybridisiert. Alle Microarrays wurden mit einer Auflösung von 5 μm mit einem DNA-Microarray-Laserscanner (DNA Microarray Scanner BA, Agilent Technologies) unter Verwendung von Ambion Ship und Exiqon Ship gemäß den Anweisungen des Herstellers gescannt. Rohe Microarray-Bilder wurden mit der Bildanalyse-/Merkmalsextraktionssoftware G2567AA (Version A.7.5, Agilent Technologies) analysiert, wobei fast alle Standardeinstellungen für miRNA-Microarrays verwendet wurden, die mit einer Rasterdatei oder Standardeinstellung geladen wurden. Die Kennzeichnung von Ungleichmäßigkeitsausreißern erfolgte mit einem 5-fachen Standardwert des konstanten Variationskoeffizienten für Merkmale ((CV) 2 Term (A) = 0,55) und Hintergrund ((CV) 2 Term (A) = 0,45). Die Intensitäten wurden durch lokale Hintergrundkorrektur und Rangkonsistenzfilterung mit LOWESS-Normalisierung normalisiert. Die Intensitätsverhältnisse wurden unter Verwendung der konservativsten Fehlerschätzung zwischen dem Universal Error Model und dem propagierten Fehler berechnet. Agilent-Arrays menschlicher Gesamtgenome wurden unter Verwendung des GE2-v4_95_Feb07-Protokolls und Standardeinstellungen gemäß den Anweisungen des Lieferanten verarbeitet. Die extrahierten MAGE-ML-Dateien wurden mit der Rosetta Resolver Bio-Software, Build 6.1.0 (Rosetta Bio-Software) weiterverarbeitet und analysiert. Um farbstoffspezifische Effekte zu kompensieren und eine statistisch relevante Datenanalyse sicherzustellen, wurde eine Farbwechsel-Farbumkehr durchgeführt. Verhältnisprofile aus einzelnen Hybridisierungen wurden fehlergewichtet kombiniert, um Verhältnisexperimente zu erstellen. Ein 1,5-facher Expressions-Cutoff für Verhältnisexperimente wurde zusammen mit der Antikorrelation von farbvertauschten Verhältnisprofilen angewendet, wodurch die Microarray-Analyse hochsignifikant wurde (P-Wert < 0,01), robust und reproduzierbar.

Um das Expressionsniveau von miR-141 zu ermitteln, wurden kleine miRNAs aus infizierten oder transfizierten A549-Zellen (48 Stunden nach der Transfektion) mit dem PureLink™ miRNA Isolation Kit (Invitrogen, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert. RT-PCR wurde verwendet, um die relative Expression von miR-141 in zwei Schritten nachzuweisen. Zunächst wurde cDNA aus kleinen miRNAs mithilfe einer Reverse-Transkriptase-Reaktion durchgeführt, gefolgt vom Amplifikationsschritt mithilfe miR-141- und RNU6B-spezifischer TaqMan-microRNA-Assays (Applied Biosystem, Darmstadt, Deutschland) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Zur Normalisierung wurden RNU6B-Spiegel verwendet. Um cDNA aus kleinem miR-141 herzustellen, wurden die folgenden Reagenzien für die Reaktion vorbereitet: 0,15 µl dNTPs (100 mM), 1 µl Reverse Transkriptase (50 U/µl), 1,5 µl 10X Reverse Transkriptase-Puffer, 0,2 µl RNase-Inhibitor (20 U). /µl), 5 µl gereinigte miRNAs (10 ng/µl) und 1 µl vom miRNA-Reverse-Primer bis zu einem Endvolumen von 20 µl unter Verwendung von RNase-freiem Wasser. Anschließend wurde die Mischung 30 Minuten bei 42 °C und anschließend 5 Minuten bei 85 °C inkubiert, um das Enzym zu inaktivieren. Die resultierende cDNA wurde dann als Matrize verwendet, um sowohl miR-141 als auch RNU6B zu amplifizieren, indem 0,5 µl jedes in Tabellen 1 aufgeführten spezifischen Primers und 10 µl SYBR-Grün, 0,2 µl RNase-Inhibitor (20 U/µl) und 1 µl cDNA verwendet wurden (100 ng/µl), um mit RNase-freiem Wasser ein Volumen von 20 µl zu erreichen. Die folgenden Parameter wurden in einem quantitativen Echtzeit-PCR-Gerät (qRT-PCR) durchgeführt: 95 °C für 5 Minuten, 40 Zyklen (95 °C für 15 Sekunden, 60 °C für 15 Sekunden und 72 °C für 15 Sekunden) und 72 °C für 3 Min.

Um die relative Genexpression zu ermitteln, wurde qRT-PCR verwendet, um die cDNA-Konstruktion und -Amplifikation in einem Schritt unter Verwendung der gereinigten Gesamt-RNA als Matrize durchzuführen. Gesamt-RNA aus transfizierten und infizierten A549-Zellen wurde mit TRIzol extrahiert und mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA) gereinigt. Die relative Expression von viralem NP, NS1, MxA und STAT3 wurde mit dem QuantiTect SYBR Green PCR Kit (Qiagen, USA) in miR-141-transduzierten Zellen oder miR-141-abgereicherten Zellen nachgewiesen. Die Oligonukleotide in Tabelle 1 wurden als spezifische Primer für die angegebenen Gene verwendet. Der Grad der durch die Oligonukleotide 5´-ggtatcgtggaaggactcatgac-3´ und 5´-atgccagtgagcttcccgttcag-3´ amplifizierten GAPDH wurde zur Normalisierung verwendet. Die folgenden Reagenzien wurden für jede Reaktion vorbereitet; 10 µl SYBR grün, 0,2 µl RNase-Inhibitor (20 U/µl), 0,25 µl Reverse Transkriptase (50 U/µl), 1 µl gereinigte Gesamt-RNA (100 ng/µl) und 0,5 µl von jedem Primer bis zu einem Endvolumen von 20 µl mit RNase-freiem Wasser. Gemäß dem Protokoll des Herstellers wurden die folgenden PCR-Parameter verwendet, um cDNA in einem Schritt aus einer Gesamt-RNA-Matrize zu konstruieren und zu amplifizieren: 50 °C für 30 Minuten, 95 °C für 3 Minuten, 40 Zyklen (95 °C für 30 Minuten). s, 60 °C für 15 s, 72 °C für 30 s) und 72 °C für 10 min [30, 31].

Mithilfe der Durchflusszytometrie wurde die kinetische Proteinexpression von NP, NS1, MxA und STAT3 in transfizierten und infizierten A549-Zellen beurteilt. Dementsprechend wurden die transfizierten Zellen zweimal mit PBS gewaschen und anschließend 3 Minuten lang trypsiniert. Den trypsinisierten Zellen wurde das komplette RPMI-Medium zugesetzt und anschließend wurden die Zellen 5 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet zum Waschen in PBS resuspendiert und zur Fixierung 3 Minuten lang in kaltem Methanol inkubiert. Die Zellen wurden in PBS mit Triton-X-100 (0,1 %) resuspendiert und zur Permeabilisierung 3 Minuten lang inkubiert. Zur Primärantikörperfärbung wurden die Zellen resuspendiert und über Nacht bei 4 °C in PBS, ergänzt mit 1 % BSA und dem verdünnten monoklonalen Maus-Anti-NP (1–500) (Abcam, ab128193), inkubiert. Nach dem Waschen mit reinem PBS wurden die Zellen zentrifugiert und im PBS mit 1 % BSA und 1–1000 Sekundärantikörpern (Ziegen-Anti-Maus-IgG, Alexa Fluor 594, Abcam, USA) resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen 2 Stunden lang im Dunkeln inkubiert. Die gleichen Anweisungen wurden für die Färbung der Zellen mit den primären und sekundären Antikörpern gegen NS1 unter Verwendung von monoklonalem Kaninchen-Anti-NS1 (1–500) (Abcam, ab91642) befolgt. und Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1–1000) (Alexa Fluor 594, Abcam, USA) [32]. Zur Färbung von MxA und STAT3, den primären Antikörpern; Es wurden polyklonales Kaninchen-Anti-MxA (Novus Biologicals, NBP132905) und monoklonales Maus-Anti-STAT3 (Abcam, ab119352) verwendet. Die gleichen sekundären Antikörper; Ziegen-Anti-Kaninchen (Alexa Fluor 488, Abcam) und Ziegen-Anti-Maus (Alexa Fluor 594) wurden verwendet, um die kinetische Expression von MxA bzw. STAT3 zu erreichen. Schließlich wurde der Durchflusszytometrie-Assay (BD Accuri 6 Plus) verwendet, um die Proteingehalte mithilfe eines resuspendierten Pellets in 500 µl PBS zu bestimmen [33, 34].

Das Expressionsprofil der viralen NP- und NS1-Proteine sowie der zellulären MxA- und STAT3-Proteine wurde mithilfe eines Immunblotting-Assays doppelt überprüft. Das Gesamtprotein wurde aus transfizierten und infizierten A549-Zellen unter Verwendung des vollständigen Lyse- und Extraktionspuffers RIPA (ThermoFisher, USA) extrahiert. Anschließend wurde das Protein mit einem Ladepuffer, der 10 % Natriumdodecylsulfat (SDS) enthielt, denaturiert und 5 Minuten lang bei 95–100 °C gekocht. 100 ng denaturiertes Protein wurden in 10 %iges Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel geladen und die Elektrophorese wurde 4 Stunden lang bei 75 V unter Verwendung der Bio-Rad Mini-Protean II-Elektrophoreseeinheit durchgeführt. Die Proteinbanden wurden dann mit dem Bio-Rad-Elektroblotting-System (Bio-Rad Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell) auf Nitrozellulosemembranen (Millipore, MA, USA) übertragen. Zur Blockierung wurde die Membran eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 30 ml Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 5 % fettfreier Trockenmilch und 0,1 % Tween-20 (pH 7,5) inkubiert. Anschließend wurde die Membran einzeln über Nacht bei 4 °C mit den zuvor beschriebenen Primärantikörpern gegen NP, NS1, MxA und STAT3 inkubiert. Die Membran wurde dann zweimal mit WesternBreeze-Lösung 16x (Invitrogen, USA) gewaschen, gefolgt von einer 2-stündigen Inkubation bei Raumtemperatur mit monoklonalem Maus-Anti-β-Actin (Sigma, Hamburg, Deutschland). Abschließend wurden die Membranen zweimal gewaschen und 2 Stunden lang bei RT mit gebrauchsfertiger 2°-Lösung alkalischer Phosphate (AP) konjugiert (Invitrogen, USA) entweder gegen Maus oder gegen Kaninchen inkubiert. Nach dem Waschen der Vertiefungen wurde der chromogene Nachweis der erwarteten Banden sofort unter Verwendung von AP-Substrat (WesternBreeze, Invitrogen, USA) durchgeführt.

Der ELISA-Assay wurde zur Quantifizierung des freigesetzten IL-6 und IFN-β unter Verwendung menschlicher ELISA-Kits (Abcam 46.042 bzw. Abcam 278.127) verwendet. Dementsprechend wurden A549-Zellen über Nacht in einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 10.000 Zellen/Well kultiviert. Dann wurden die Zellen mit einem 20 µl optimalen Medium transfiziert, das 25 µg/Well entweder miR-141-Inhibitor oder Vorläufer enthielt, suspendiert in 2 µl HyperFect. Die transfizierten Zellen wurden 6 Stunden lang inkubiert; Anschließend wurde in jede Vertiefung anstelle des Transfektionsmediums frisches RPMI-Medium gegeben und die Zellen wurden zwei Tage lang inkubiert. Andere Zellen wurden vor der IAV-Infektion zwei Stunden lang und kontinuierlich während der Infektion dem IFN-β (5 IU/ml) ausgesetzt. Schließlich wurden die behandelten und transfizierten Zellen mit IAV mit einer MOI von 0,05 infiziert, gefolgt von einer Inkubationszeit von (0, 6, 12, 24 und 48 Stunden). Zu jedem Zeitpunkt wurden 50 µl der lysierten Zellen in die ELISA-Platte überführt und 3 Stunden lang bei Raumtemperatur mit dem gleichen Volumen der Kontrolllösung und 1X biotinyliertem Antikörper inkubiert. Nach dem Waschen wurden 100 µl 1X Streptavidin-HRP-Lösung in jede Vertiefung gegeben, die dann 30 Minuten lang im Dunkeln inkubiert wurde. Schließlich wurden 100 µl der chromogenen TMB-Substratlösung in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von einer 15-minütigen Inkubation bei RT ohne Licht. Die Stopplösung wurde hinzugefügt und die Absorption jeder Vertiefung wurde mit 450 nm überwacht [35].

Zur Quantifizierung der Zyklusschwelle (Ct) jeder untersuchten Genexpression wurden Delta-Delta-Ct-Gleichungen wie zuvor beschrieben verwendet: (1) Delta-Ct = Ct-Wert für Gen – Ct-Wert für GAPDH, (2) (Delta–Delta -Ct) = Delta-Ct für Experimente – Delta-Ct für die Kontrolle, (3) relative Expression des Zielgens = (2− Delta−Delta ct) [36, 37]. Die statistische Analyse erfolgte mithilfe des Schüler-T-Tests zwischen zwei Gruppen. Ein P-Wert ≤ 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Um zu untersuchen, ob eine IAV-Infektion die Expression von miR-141 in infizierten Zellen induziert, wurden A549-Zellen in 6 Vertiefungen/Platten ausgesät und mit verschiedenen IAV-Stämmen (MOI = 1), einschließlich A/WSN/33, A/PR/, infiziert. 8/34 und A/pdm/09, gefolgt von einer Inkubation über Nacht. Interessanterweise veränderte sich der miR-141-Spiegel bei einer Infektion mit dem Stamm IAV/WSN/33 deutlich um das Zwölffache. Darüber hinaus stieg der miR-141-Spiegel bei einer Infektion mit Influenza A/pdm/09 im Vergleich zu nicht infizierten Zellen (Kontrolle) um das Sechsfache an (Abb. 1A; Tabelle 2). Darüber hinaus wurde das Expressionsniveau von miR-141 in A549-Zellen, die mit verschiedenen MOIs von IAV/WSN/33 infiziert waren, einschließlich MOI von 0,05, 0,1, 0,5 und MOI von 1, dosisabhängig signifikant hochreguliert (Abb. 1B; Tisch 3). Darüber hinaus untersuchten wir nach der Infektion das relative Expressionsprofil von MxA als Interferon-induzierbares Gen und antivirales Protein. Überraschenderweise stieg das relative MxA-Expressionsprofil sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene nach der Infektion mit niedrigen MOIs von IAV/WSN/33, angezeigt durch qRT-PCR, deutlich an (Abb. 1C; Tabelle 4). Die Immunblotting-Analyse der MxA-Proteinexpression bestätigte außerdem die Überexpression des MxA-Proteins in A549-Zellen, die mit niedrigen MOIs von IAV infiziert waren, während es in Zellen, die mit hohen MOIs, einschließlich MOIs von 1, 1,5 und MOIs von 2, infiziert waren, vollständig verschwand (Abb. 1D und). Supp. Abbildung 1). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Infektion mit einem hohen MOI von IAV das Expressionsprofil von MxA stark hemmt, was darauf hindeutet, dass die Fähigkeit von IAV, die Expression von MxA posttranskriptionell zu regulieren, möglicherweise über hochreguliertes miR-141 erfolgt.

Expressionsprofil von miR-141 und MxA in IAV-infizierten Zellen. (A) Relatives Expressionsniveau von miR-141 in A549-Zellen, die mit verschiedenen IAV-Stämmen infiziert sind, einschließlich A/WSN/33, A/PR/8/34 und A/pdm/09, angezeigt durch Faltungsänderung mittels qRT-PCR. (B) Expressionsniveaus von miR-141 in A549-Zellen, die mit verschiedenen MOIs von IAV/WSN/33 infiziert sind, angezeigt durch qRT-PCR. Fehlerbalken geben die Standardabweichung (STD) von drei unabhängigen Experimenten an. (C) Relative Genexpression von MxA in A549-Zellen, die mit IAV/WAN/33, verschiedenen MOIs, infiziert waren, für 24 Stunden, angezeigt durch qRT-PCR. Fehlerbalken geben die STD von drei unabhängigen Experimenten an. Für die statistische Analyse verwendeter zweiseitiger Student-t-Test (*) zeigt P ≤ 0,05 an, während (**) P ≤ 0,01 angibt. (D) Immunblotting-Analyse der MxA-Proteinexpression in A549-Zellen, die 24 Stunden lang mit verschiedenen MOIs von IAV/WSN/33 infiziert waren, β-Actin-Expressionsprofil als interne Kontrolle aufgetrennt

Wie in Abb. 2A gezeigt, zeigten die transfizierten Zellen mit Prä-miR-141- oder miR-141-Inhibitor im Vergleich zu kontrolltransfizierten Zellen vernachlässigte Unterschiede in der A549-Zellproliferationsrate, was durch eine stabile Zellmorphologie belegt wird. Darüber hinaus war die Anzahl der lebenden A549-Zellen, die entweder mit dem Inhibitor-Antagonisten miR-141 oder mit Prä-miR-141 transfiziert wurden, ungefähr unparteiisch, ohne signifikante Unterschiede im Vergleich zu kontrolltransfizierten Zellen und unbehandelten Zellen (Abb. 2B). Ebenso zeigte die Zelllebensfähigkeitsrate transfizierter A549-Zellen mit miR-141-Inhibitor oder Prä-miR-141 vernachlässigbare Unterschiede in der Zelllebensfähigkeitsrate im Vergleich zu kontrolltransfizierten Zellen und unbehandelten Zellen (Abb. 2C). Diese Daten zeigen, dass die Lebensfähigkeit, Morphologie und Anzahl der überlebenden Zellen bei der Transfektion erhalten blieben, was darauf hindeutet, dass die Transfektion des Prä-miR-141- und miR-141-spezifischen Inhibitors unabhängig von einer Infektion keine zytotoxische Wirkung auf A549-Zellen hat.

Zytotoxischer Einfluss der Prä-miR-141- und spezifischen Inhibitortransfektion in A549-Zellen. (A) A549-Zellmorphologie, angezeigt durch ein umgekehrtes Mikroskop nach 48-stündiger Transfektion mit entweder Prä-miR-141 oder einem Inhibitor-Antagonisten miR-141 im Vergleich zu kontrolltransfizierten und unbehandelten Zellen. (B) Nach der Transfektion mit dem miR-141-Inhibitor oder Vorläufer die Anzahl der lebenden A549-Zellen. (C) Zelllebensfähigkeitsrate transfizierter A549-Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen des Prä-miR-141 und des spezifischen Inhibitors, angezeigt durch die Absorptionsrate behandelter Zellen mit MTT-Mittel. Fehlertafeln stellen die STD von drei unabhängigen Experimenten dar. Für die statistische Analyse wurde der zweiseitige Student-T-Test verwendet

Um den molekularen Einfluss von miR-141 auf die IAV-Replikation zu untersuchen, wurden miR-141-transfizierte Zellen mit Influenza A/WSN/33 bei einer niedrigen Infektionsmultiplizität (MOI 0,05) infiziert und über Nacht inkubiert. Das Expressionsprofil von viralem NP und NS1 infizierter A549-Zellen wurde mittels qRT-PCR überwacht. Infolgedessen war die relative Expression von NP und NS1 in miR-141-überexprimierenden Zellen im Vergleich zu dem, was in mit miR-141-Inhibitor- und Kontrollzellen transfizierten Zellen beobachtet wurde, dramatisch um das 7- bzw. 5-fache erhöht. Bemerkenswerterweise zeigten die mit IFN-β vorbehandelten Zellen erwartungsgemäß eine starke Verringerung der viralen NP- und NS1-Expression, wie sie in A549-Zellen hervorgerufen wurde, die mit einem Inhibitorantagonisten miR-141 transfiziert wurden (Abb. 3A; Tabelle 5). Interessanterweise war das Proteinexpressionsprofil sowohl von viralem NP als auch von NS1 in A549-Zellen, die mit dem Inhibitor-Antagonisten miR-141 transfiziert wurden, stark erschöpft, während ihre Expression in mit Prä-miR-141 transfizierten Zellen deutlich anstieg, was durch Immunblotting angezeigt wurde (Abb. 3B und Supp . Figur 2). Ebenso verringerte sich die kinetische Proteinexpression von viralem NP und NS1 in mit dem miR-141-Inhibitor transfizierten Zellen sowie in mit IFN-β behandelten Zellen deutlich, was durch Durchflusszytometrie angezeigt wurde, da ihre Expression nur in 0,2 % und 4 % nachgewiesen wurde % der gefärbten Zellen (Abb. 3C). Das Proteinexpressionsprofil von NP und NS1 zeigte jedoch eine deutliche Expression in mehr als 55 % bzw. 45 % der mit prä-miR-141 transfizierten gefärbten Zellen im Vergleich zu kontrolltransfizierten Zellen, wie in Abb. 3C dargestellt. Diese Beobachtung legt nahe, dass sowohl der Inhibitorantagonist miR-141 als auch IFN-β wahrscheinlich die IAV-Replikation hemmen können. Zusammengenommen bestätigen diese Daten, dass miR-141 eine Rolle bei der Aufrechterhaltung des Replikationszyklus von IAV spielt.

Expressionsprofil von viralem NP und NS1 in A549-Zellen, die mit pre-miR-141 oder einem spezifischen Inhibitor transfiziert wurden. (A) Relative Genexpression von viralem NP und NS1 in A549-Zellen, die mit IFN-β behandelt oder mit pre-miR-141 oder einem spezifischen Inhibitor transfiziert wurden, im Vergleich zu nicht infizierten Zellen (Kontrollzellen). Fehlerbalken geben die STD von drei unabhängigen Experimenten an. Zweiseitiger Student-T-Test, der für die statistische Analyse verwendet wird. (*) zeigt P-Werte ≤ 0,05 an und (**) zeigt P ≤ 0,01 an. (B) Immunblotting-Analyse der viralen NP- und NS1-Proteinexpression in infizierten A549, die entweder mit IFN-β behandelt oder mit miR-141-Überexpressionsvektor oder spezifischem Inhibitor transfiziert wurden, im Vergleich zu Kontrollzellen, β-Actin-Expressionsprofil als interne Kontrolle abgetrennt. (C) Der durchflusszytometrische Assay quantifiziert das kinetische Proteinexpressionsprofil von NP (in blauen Punkten) und NS1 (in roten Punkten) in infizierten und transfizierten A549-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen

Wie in Abb. 4 (A und B) dargestellt, zeigten die Microarray-Daten transfizierter A549-Zellen mit Prä-miR-141, dass Dutzende von mRNAs, deren Expression durch das Vorhandensein hoher miR-141-Spiegel negativ beeinflusst wurde, sowohl von Exiqon als auch von angegeben Ambion-Chips. Viele mRNAs wurden jedoch nicht durch den miR-141-Spiegel in A549-Zellen beeinflusst. Im Gegenteil, die Expressionsniveaus vieler Gene wurden als Reaktion auf den hohen miR-141-Spiegel herunterreguliert. Bemerkenswert ist, dass durch miR-141 herunterregulierte Gene die mRNA vieler Transkripte anreicherten, die einer Virusrepression ausgesetzt waren, darunter MX1, das für das Myxovirus-Resistenzprotein kodiert, IFI27, das für das Interferon-Alpha-induzierbare Protein 27 kodiert, LAMP3, das für das lysosomal assoziierte Membranprotein3 kodiert, Signaltransducer und Aktivator 3 (STAT3). ) und Killer-ähnlicher Rezeptor C4 (KLRC4) (Abb. 4C). Alternativ waren die am stärksten erhöhten mRNAs mit der Virusreplikation und Zellentwicklung verbunden, wie z. B. IGFBP-1, das für das Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-Bindungsprotein 1 kodiert, IGF2, das für den Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor II (IGFBP-7) kodiert, und EGR1, das für kodiert frühes Wachstumsreaktionsprotein1 und RASSF4, die für die RAS-Assoziationsdomänenfamilie kodieren (Abb. 4C). Diese Daten weisen auf die molekulare Wirkung von miR-141 hin, um die IAV-Replikation sicherzustellen, und deuten auf die mögliche regulatorische Rolle von miR-141, wenn es erhöht wird, bei der Regulierung der Genexpression von Mx1, IFI27, HBP17, LAMP3, STAT3 und KLRC410 in A549-Zellen hin.

Microarray-Analyse transfizierter A549-Zellen mit pre-miR-141. (A) Microarray-Analyse der Genexpression in A549-Zellen, die mit Prä-miR-141-Überexpression transfiziert wurden, im Vergleich zu kontrolltransfizierten Zellen unter Verwendung einer miRNA-Bibliothek von Exiqon. (B) Microarray-Analyse der Genexpression in A549-Zellen, die mit Prä-miR-141-Überexpression transfiziert wurden, im Vergleich zu kontrolltransfizierten Zellen unter Verwendung von Oligonukleotiden von Ambion. Die blaue Farbe zeigt die anhaltende Genexpression an, die rote Farbe zeigt die hochregulierten Gene an und die grüne Farbe zeigt die herunterregulierten Gene an. (C) Die Expression der für eine antivirale Strategie relevantesten Gene zeigt die hochregulierten Gene in roten Säulen und die herunterregulierten Gene in grün an. Fehlerbalken zeigen die STD zwischen Exiqon- und Ambion-Daten an

Wir haben die Knockdown-Effizienz und die Veränderung des miR141-Expressionsniveaus in transfizierten A549-Zellen bestätigt, die durch die Faltungsänderung mithilfe von qRT-PCR angezeigt werden. Die relative Expression von miR-141 erhöhte sich in mit Prä-miR-141 transfizierten Zellen deutlich um das Zwölffache. Im Gegensatz dazu sank sein Expressionsniveau in mit dem miR-141-Inhibitor transfizierten Zellen im Vergleich zu kontrolltransfizierten Zellen dramatisch (Abb. 5A; Tabelle 6). Um die mögliche Regulation der MxA- und STAT3-Expression durch miR-141 zu überprüfen, wurde das Expressionsprofil von MxA und STAT3 in infizierten und transfizierten A549-Zellen mit dem Inhibitor-Antagonisten miR-141 und pre-miR-141 mittels qRT-PCR und Durchflusszytometrie quantifiziert und Immunblotting-Assay. Überraschenderweise stieg die relative Genexpression von MxA und STAT3 in mit miR-141-Inhibitor transfizierten Zellen stark um das Siebenfache bzw. Dreifache an, während ihre Expression in miR-141-transduzierten Zellen dramatisch abnahm (Abb. 5B; Tabelle 6). Darüber hinaus war die kinetische Proteinexpression von MxA und STAT3 in miR-141-transduzierten Zellen deutlich vermindert, was durch Durchflusszytometrie angezeigt wurde, da ihre Expression nur in 5 % der gefärbten Zellen nachgewiesen wurde (Abb. 5C). Das Proteinexpressionsprofil von MxA und STAT3 veränderte sich jedoch deutlich in mehr als 65 % der gefärbten Zellen, die mit dem Inhibitorantagonisten miR-141 transfiziert wurden, ebenso wie ihr Expressionsprofil in mit IFN-β vorbehandelten Zellen, wie in Abb. 5C dargestellt. Die doppelte Überprüfung der MxA- und SATA3-Proteinexpressionsprofile durch Western Blot bestätigte außerdem die Abnahme beider Proteine in infizierten A549-Zellen, die mit prä-miR-141 transfiziert wurden, im Vergleich zu kontrolltransfizierten und unbehandelten Zellen. Im Gegensatz dazu zeigte ihre Expression eine vollständige Erholung in Zellen, die mit dem Inhibitor-Antagonisten miR-141 transfiziert wurden (Abb. 5D und Supp. Abb. 3). Diese Ergebnisse weisen auf die mögliche Regulierung von MxA und STAT3 durch miR-141 und die Fähigkeit des miR-141-Inhibitors hin, ihr Expressionsprofil in infizierten A549-Zellen wiederherzustellen, was anschließend die IAV-Replikation stört.

Die Korrelation zwischen dem miR-141-Spiegel und dem Expressionsprofil von MxA und STAT3 in infizierten A549-Zellen. (A) Quantifizierung von miR-141 im Steady-State in infizierten A549-Zellen mit einer MOI von 0,5 und transfiziert mit entweder Prä-miR-141- oder miR-141-Inhibitor im Vergleich zu nicht infizierten Zellen (Kontrolle) mittels qRT-PCR. (B) Relative Genexpression von MxA und STAT3 in infizierten A549-Zellen, die entweder mit einem spezifischen Inhibitor gegen miR-141 oder Prä-miR-141 transfiziert wurden, im Vergleich zu kontrolltransfizierten Zellen mittels qRT-PCR. Fehlerbalken geben die STD von drei unabhängigen Experimenten an. Zweiseitiger Student-T-Test, der für die statistische Analyse verwendet wird. (*) zeigt P-Werte ≤ 0,05 an und (**) zeigt P ≤ 0,01 an. (C) Der durchflusszytometrische Assay quantifiziert das kinetische Proteinexpressionsprofil von MxA (in blauen Punkten) und STAT3 (in roten Punkten) in infizierten und transfizierten A549-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen. (D) Die Western-Blot-Analyse zeigt das Proteinexpressionsniveau von MxA und STAT3 in infizierten und transfizierten Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen, wobei das β-Actin-Expressionsprofil als interne Kontrolle abgetrennt wurde

Um den Zusammenhang zwischen miR-141-Expressionsniveau und Zytokinproduktion bei Infektion zu untersuchen, wurde die Konzentration von sekretiertem IFN-β und IL-6 in transfizierten A549-Zellen in einem Zeitverlaufsexperiment überwacht. Wie in Abb. 6A gezeigt, stieg die Konzentration des produzierten IFN-β in infizierten A549-Zellen, die mit miR-141-Inhibitor transfiziert wurden, 24 Stunden nach der Infektion deutlich auf bis zu 350 μm/ml an. Im Gegensatz dazu nahm die Menge an produziertem IFN-β in mit prä-miR-141 transfizierten Zellen im Vergleich zu transfizierten Kontrollzellen signifikant ab. Diese Beobachtung weist auf den molekularen Einfluss von miR-141 bei der Regulierung der IFN-Signalübertragung während einer IAV-Infektion hin. Im Gegensatz zu IFN-β stieg der Spiegel des produzierten IL-6 in miR-141-transduzierten Zellen 24 Stunden nach der Infektion deutlich auf bis zu 400 μm/ml an, während er in mit dem Inhibitor-Antagonisten miR-141 transfizierten Zellen deutlich abnahm, was auf die Rolle hinweist von miR-141 im IL-6-Signalweg in infizierten Zellen (Abb. 6B). Zusammengenommen deuten diese Daten stark auf die Beteiligung von miR-141 an dem Mechanismus hin, durch den IAV den IFN-β-Signalweg und die zelluläre Immunantwort nach einer Infektion reguliert.

Mengen an produzierten Zytokinen in infizierten und transfizierten A549-Zellen. (A) Die Konzentration des produzierten IFN-β (pm/ml) in den flüssigen Medien infizierter und transfizierter A549-Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten im Vergleich zu seiner Konzentration in den flüssigen Medien unbehandelter Zellen (NT) und damit behandelter Zellen Transfektionsreagenz (Kontrolle). (B) Die Konzentration von IL-6 in den Kulturmedien infizierter und transfizierter A549-Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten im Vergleich zu seiner Konzentration in den flüssigen Medien von NT-Zellen und kontrollbehandelten Zellen. Fehlerbalken zeigen die STD von vier verschiedenen Replikaten an

Als Mitglied der miR-200-Familie wird miR-141 typischerweise der Immunsignalisierung, den Entzündungsfunktionen, der Zelldifferenzierung und dem Zellzyklus des Wirts zugeschrieben und trägt zu vielen zellulären Prozessen wie Zellproliferation, Apoptose und antiviraler Abwehr bei [38] . Dementsprechend werden einige miRNAs dazu veranlasst, die virale Pathogenese zu regulieren, indem sie proinflammatorische Signalwege während der Infektion modulieren. Beispielsweise werden miR-29c und miR-451 bei einer IAV-Infektion zurückgewonnen, um die Entzündungsreaktionen der Zellen zu unterdrücken [39, 40]. Wie in einer Pilotstudie gezeigt, wurde miR-141 bei einer Infektion mit dem Influenzavirus H5N1 signifikant exprimiert, um den transformierenden Wachstumsfaktor Beta 2 (TFG-β2) in infizierten Zellen herunterzuregulieren [41]. Gleichermaßen zeigt die vorliegende Studie deutlich, dass eine Infektion mit dem Influenzavirus H1N1 die Expression von zellulärem miR-141 stimuliert. Sobald miR-141 in A549-Zellen überexprimiert wird, hemmt es die Translation von MxA und STAT3 nach einer IAV-Infektion und einer IFN-β-Behandlung. Durch die Täuschung von miR-141 in infizierten Zellen wird die Virusreplikation durch die Wiederherstellung der MxA- und STAT3-Expressionsprofile erheblich gehemmt. Wichtig ist, dass unsere Ergebnisse die mögliche Beteiligung von miR-141 an der IAV-vermittelten Interferonsignalisierung bei einer Infektion zeigen, um die Virusreplikation sicherzustellen. Darüber hinaus zeigen die hier bereitgestellten Microarray-Daten deutlich die Fähigkeit von miR-141, eine Vielzahl antiviraler Genexpressionen in transfizierten A549-Zellen zu regulieren. Zu den gezielten mRNAs, die eine fast dreifache Veränderung in miR-141-transduzierten Zellen beeinflussten, gehörten Interferon-Alpha-induzierbares Protein 27 (IFI27) und lysosomal assoziiertes Membranprotein3 (LAMP3) mRNAs.

Als zelluläre Immunantwort auf eine IAV-Infektion ist IL-6 ein pleiotropes Zytokin, das als Reaktion auf Zellverletzungen und Infektionen produziert wird [42]. Sobald es auf seinen spezifischen Rezeptor abzielt, stimuliert IL-6 eine Signalkaskade, die mit dem JAK/STAT3-Aktivierungsweg verbunden ist. Die JAK/STAT-Signalisierung fördert die Transkription mehrerer nachgeschalteter Gene, die mit zellulären Signalprozessen zusammenhängen, einschließlich Zytokinen, Rezeptoren, Adapterproteinen und Proteinkinasen, einschließlich GADD45 beta, SOCS1, MAP3K8, SOCS3 und Mx1 [43]. Die Anzahl der Gene, die durch die IL-6-Aktivität reguliert werden, könnte die pleiotrope Natur dieses Interleukins erklären [44]. Dementsprechend wurden die biologischen Folgen der IL-6-Produktion sowohl mit entzündungsfördernden als auch entzündungshemmenden Wirkungen in Verbindung gebracht, was die zentrale Rolle von IL-6 bei der Aktivierung und Regulierung der Immunantwort unterstreicht [45]. Auf dieser Grundlage stellten wir die Hypothese auf, dass das Targeting von STAT3 durch hochreguliertes miR-141 die Funktion von produziertem IL-6 während einer IAV-Infektion stört, indem es die damit verbundene Genexpression hemmt. Darüber hinaus ist die steigende Menge an produziertem IL-6 in infizierten Zellen, die mit miR-141-Mimetikum vortransfiziert wurden, auf die exponentielle Replikation von IAV zurückzuführen, im Gegensatz zu den Zellen, die mit einem Inhibitor-Antagonisten miR-141 vortransfiziert wurden.

Andererseits täuscht IAV die zellulären Prozesse des Wirts, um sich erfolgreich zu replizieren. So hemmt das Influenzavirus die Synthese von Wirtsproteinen, erleichtert die Expression seiner Proteine und korreliert häufig Pathogenität mit Wachstumsrate. Es ist bekannt, dass IAV in den Wirt gelangt, indem es an virales HA und Sialinsäure als anfänglichen Rezeptor bindet [22, 46]. Sobald das Virion in die Zellen gelangt, wird die Expression des RNA-Helikase-Retinsäure-induzierbaren Gens I (RIG-I) induziert und eine kritische Signalkaskade stimuliert, gefolgt von der Transkription von IFN-β [17]. IFN-β aktiviert den STATs-Komplex, was zur Initiierung einer definierten Zellsignalisierung, des regulären JAK/STAT-Signalwegs, führt [47]. Die Sekretion von IFN-β und/oder IFN-α aus infizierten Zellen löst ein Ereignis aus, das die Expression IFN-abhängiger Gene stimuliert [18]. Auf diesem Weg assoziieren JAKs mit dem IFN-β-Rezeptor, und anschließend werden STATs an konservierten Tyrosinresten phosphoryliert und vom Rezeptor freigesetzt, wo Konformationsänderungen zu Homo-IFN (Typ 1, II und III) führen. Diese Änderung legt ein nukleares Lokalisierungssignal offen, das die nukleare Translokation erleichtert. Im Zellkern binden STATs an eine spezifische Nukleotidsequenz, die als Interferon-stimuliertes regulatorisches Element (ISRE) bekannt ist, und dienen als Transkriptionsaktivatoren, die die ISG-Expression steuern, einschließlich PKR, IGS15 und MxA (48, 49). Das humane Myxovirus-Resistenzprotein A (MxA) ist das zentrale antivirale Molekül, das Zellen vor Infektionen und Apoptose schützt. Das menschliche MxA-Protein, das vom Interferon-induzierbaren MX1-Gen kodiert wird, ist ein intrazellulärer Anti-IAV-Faktor. Die Stelle von MX1 befindet sich auf dem langen Arm von Chromosom 21 und enthält 17 Exons, die sich über 33 kb erstrecken [50]. MxA gilt als große GTPase, die in Zellkulturen eine breite Resistenz gegen Influenza- und andere Viren vermittelt. Es wurde festgestellt, dass eine Überexpression des MxA-Proteins den Handel und die Übertragung viraler Proteine stört, was zu dessen Akkumulation in Zellen führt [49].

Mechanistisch gesehen zeigten mehrere Studien, dass das IAV-NS1-Protein ein viraler Regulator der zellulären Genexpression ist, indem es den prä-mRNA-Prozess hemmt [51, 52]. Darüber hinaus hemmt virales NS1, das eine RNA-bindende Aktivität aufweist, die Aktivierung von RIG-I und verhindert Interferon-Signalwege in infizierten Zellen[53]. Ebenso haben wir bestätigt, dass die Interferonproduktion nach einer IAV-Infektion als zelluläre Immunantwort stimuliert wird; Allerdings kann IAV in letzter Zeit eine weitere Interferonproduktion verhindern. Dementsprechend wird die Expression mehrerer Interferon-induzierbarer Gene in infizierten Zellen erfolgreich induziert, darunter MxA und STAT3, auf die hochreguliertes miR-141 abzielt. Diese Ergebnisse legen die Rolle von miR-141 bei der Blockierung des JAK/STAT-Einzelwegs nach einer Infektion nahe. Basierend darauf nehmen wir an, dass eine IAV-Infektion die Expression von miR-141 in infizierten Zellen stimuliert, um das Expressionsprofil von MxA als Interferon-induzierbarem Gen und STAT3 zu regulieren, das bei einer Infektion als Reaktion auf die IL-6-Produktion stimuliert wird.

Influenzaviren haben Strategien entwickelt, um den angeborenen und adaptiven Abwehrreaktionen ihrer Wirte entgegenzuwirken. Die Induktion von Interferon (IFN)-stimulierten Genen spielt eine entscheidende Rolle beim Schutz vor Virusangriffen. Eine Infektion mit Influenzaviren führt normalerweise zu einer Hochregulierung der wirksamen IFN-regulierten antiviralen Wirtsfaktoren, wie der Myxovirus-Resistenzproteine (Mx) und anderer IFN-induzierbarer Gene. Als Gegenmaßnahme unterdrücken Influenzaviren aktiv das menschliche Ortholog des Mx-Proteins (MxA); Der Mechanismus, der dieser Unterdrückung zugrunde liegt, ist jedoch noch immer kaum verstanden. Wirts-microRNAs (miRNAs) mit einer Länge von etwa 22 Nukleotiden fungieren als globale Regulatoren der Genexpression in Säugetierzellen und stellen somit attraktive Ziele für Viren dar, um Wirtszellfunktionen an sich zu reißen. Die aktuelle Studie untersuchte eingehend den möglichen Beitrag von zellulärem miR-141 zur IAV-Replikation. Die Microarray-Daten in A549-Zellen, die miR-141 überexprimierten, zeigten die Herunterregulierung verschiedener antiviraler Gene, einschließlich MxA und STAT3. Interessanterweise kann die Überexpression von miR-141 in infizierten A549-Zellen die Fähigkeit von IAV erhöhen, seinen Replikationszyklus sicherzustellen. Umgekehrt reduzierte die Hemmung von miRNA-141 die Virusreplikation deutlich. Insbesondere konnten wir nachweisen, dass die antiviralen Gene MxA und STAT3 während der IAV-Infektion von A549-Zellen in miRNA-141-abhängiger Weise unterwandert wurden. Im Gegensatz dazu wird in benachbarten, nicht infizierten Zellen die Interferonproduktion infizierter Zellen induziert. Die Täuschung von miR-141 in infizierten Zellen stellte das Expressionsprofil von MxA und STAT3 wieder her, was zu einer deutlichen Störung der IAV-Replikation führte. Bemerkenswert ist die Menge an miR-141 in infizierten A549-Zellen, die in das produzierte IFN-β und IL-6 eingebaut ist. Zusammengenommen decken diese Daten einen effizienten miRNA-basierten Mechanismus auf, der das Influenzavirus vor einer entscheidenden antiviralen Wirtsreaktion schützt und miR-141 als glaubwürdiges therapeutisches Ziel identifiziert.

Alle Daten, die diese Ergebnisse stützen, sind jederzeit auf Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

Influenza-A-Virus

Interferon-beta

Interferon-alpha-induzierbares Protein 27

Interleukin 6

IFN-stimulierte Gene

Lysosomal assoziiertes Membranprotein3

Retinsäure-induzierbares Gen I

Roswell Park Memorial Institute

Transformierender Wachstumsfaktor Beta 2

Madin-Darby-Hundeniere

Vielzahl von Infektionen

Smith GJD, Vijaykrishna D, Bahl J, Lycett SJ, Worobey M, Pybus OG, et al. Ursprünge und evolutionäre Genomik der von Schweinen verursachten H1N1-Influenza-Epidemie im Jahr 2009. Natur. 2009;459:1122–5.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Morens DM, Taubenberger JK, Fauci AS. Das anhaltende Erbe des Influenzavirus von 1918. N Engl J Med. 2009;361:225–9.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Worobey M, Han GZ, Rambaut A. Entstehung und Pathogenese des pandemischen H1N1-Influenzavirus von 1918. Proc Natl Acad Sci. 2014;111:8107–12.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bai L, Zhao Y, Dong J, Liang S, Guo M, Liu X, et al. Eine Koinfektion mit dem Influenza-A-Virus erhöht die Infektiosität von SARS-CoV-2. Zellauflösung 2021;31:395–403.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Harris A, Cardone G, Winkler DC, Heymann JB, Brecher M, White JM, et al. Pleiomorphie des Influenzavirus, charakterisiert durch Kryoelektronentomographie. Proc Natl Acad Sci. 2006;103:19123–7.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dou D, Revol R, Östbye H, Wang H, Daniels R. Influenza ein Viruszelleintritt, Replikation, Virionassemblierung und -bewegung. Frontimmunol. 2018;9:1–17.

Artikel Google Scholar

Huang QY, Song K, Xu C, Bolon DNA, Wang JP. Quantitative Strukturanalyse des Influenzavirus durch Kryo-Elektronentomographie und Faltungs-Neuronale Netze * Entsprechend geteilt. Autor Abteilung für Biochemie und Molekulare Pharmakologie, Abteilung o der University of Massachusetts Medical School; 2021.

Bartel DP. MicroRNAs: Zielerkennung und regulatorische Funktionen. Zelle. 2009;136:215–33.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Maher E, Gedawy G, Fathy W, Farouk S, El Maksoud AA, Guirgis AA et al. Hsa-miR-21-vermittelter Zelltod und Tumormetastasen: eine mögliche Doppelreaktion bei der Entstehung von Darmkrebs. J-Krebs im Nahen Osten. 2020;11.

CAI X, HAGEDORN CH. Menschliche microRNAs werden aus verkappten, polyadenylierten Transkripten verarbeitet, die auch als mRNAs fungieren können. RNA. 2004;10:1957–66.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Na YJ, Kim JH. Verständnis der Kooperativität von microRNAs über microRNA-Assoziationsnetzwerke. BMC-Genomik. 2013;14:17.

Artikel Google Scholar

Skalsky RL, Cullen BR. Viren, microRNAs und Wirtsinteraktionen. Annu Rev Microbiol [Internet]. Jahresrückblicke; 2010;64:123–41. Verfügbar unter: https://doi.org/10.1146/annurev.micro.112408.134243.

Kunden RD, Khan JQ, Ghezelbash S, Wilson JA. Die Rolle der leberspezifischen microRNA miRNA-122 im HCV-Replikationszyklus. Int J Mol Sci. 2020.

Jopling CL. Targeting von microRNA-122 zur Behandlung einer Hepatitis-C-Virusinfektion. Viren. 2010. S. 1382–93.

Xu H, Xu SJ, Xie SJ, Zhang Y, Yang JH, Zhang WQ et al. MicroRNA-122 unterstützt eine robuste angeborene Immunität in Hepatozyten, indem es auf den RTKs/STAT3-Signalweg abzielt. Cooper JA, Goff SP, Enomoto Y, Herausgeber. Elife [Internet]. eLife Sciences Publications, Ltd; 2019;8:e41159. Verfügbar unter: https://doi.org/10.7554/eLife.41159.

Long JS, Mistry B, Haslam SM, Barclay WS. Wirts- und Virusdeterminanten der Speziesspezifität des Influenza-A-Virus. Nat Rev Microbiol [Internet]. 2019;17:67–81. Verfügbar unter: https://doi.org/10.1038/s41579-018-0115-z.

Jiang Z, Wei F, Zhang Y, Wang T, Gao W, Yu S, et al. IFI16 erkennt virale RNA direkt und verstärkt die RIG-I-Transkription und -Aktivierung, um eine Influenzavirus-Infektion einzuschränken. Nat Microbiol. 2021;6:932–45.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Trinchieri G. Typ-I-Interferon: Freund oder Feind? J Exp Med. 2010;207:2053–63.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

[PubMed] Jung HJ, Park SH, Cho KM, Jung K, Il, Cho D, Kim TS. Threonyl-tRNA-Synthetase fördert die Reaktionen von T-Helferzellen vom Typ 1, indem sie über einen NF-κB-Weg die Reifung dendritischer Zellen und die IL-12-Produktion induziert. Frontimmunol. 2020;1

Khalil H. Influenza, ein Virus, stimuliert die Autophagie, um die IFN-β-Produktion der Wirtszelle zu untergraben. Ägypten J Biochem Mol Biol. 2012;30:283–99.

CAS Google Scholar

Zhou Z, Jiang X, Liu D, Fan Z, Hu X, Yan J et al. Autophagie ist an der Replikation des Influenza-A-Virus beteiligt. Autophagie [Internet]. Taylor & Francis; 2009;5:321–8. Verfügbar unter: https://doi.org/10.4161/auto.5.3.7406.

Khalil H. Die intrazelluläre Signalübertragung, die mit einer Influenza-Virusinfektion verbunden ist. Pediatr Infect Dis [Internet]. 2017;1:38. Verfügbar unter: http://pediatric-infectious-disease.imedpub.com/the-intrazellulär-signalling-that-associated-with-influenza-a-virus-infection.php?aid=18481.

Khalil H, Abd ElHady A, Elawdan KA, Mohamed D, Mohamed DD, Abd El Maksoud AI et al. Die mechanische Autophagie als Teil der zellulären Immunität; Fakten und Merkmale bei der Behandlung medizinischer Störungen. Immunol Invest [Internet]. Taylor & Francis; 2022;51:266–89. Verfügbar unter: https://doi.org/10.1080/08820139.2020.1828453.

Abd El Maksoud AI, Elebeedy D, Abass NH, Awad AM, Nasr GM, Roshdy T et al. Methylomische Veränderungen autophagiebezogener Gene durch den Legionella-Effektor Lpg2936 in infizierten Makrophagen. Front Cell Dev Biol [Internet]. 2020;7:390. Verfügbar unter: https://www.frontiersin.org/article/https://doi.org/10.3389/fcell.2019.00390.

Jounai N, Takeshita F, Kobiyama K, Sawano A, Miyawaki A, Xin KQ et al. Das Atg5{extendash}Atg12-Konjugat ist mit angeborenen antiviralen Immunantworten verbunden. Proc Natl Acad Sci [Internet]. Nationale Akademie der Wissenschaften; 2007;104:14050–5. Verfügbar unter: https://www.pnas.org/content/104/35/1

Khalil H, Maksoud AIA, El, Roshdey T, El-Masry S. Guava-Flavonoidglykoside verhindern eine Infektion mit dem Influenza-A-Virus durch Wiederherstellung der P53-Aktivität. J Med Virol [Internet]. Wiley Online-Bibliothek; 2018; Verfügbar unter: http:https://doi.org/10.1002/jmv.25295.

Khalil H, El Malah T, El Maksoud AIA, El Halfawy I, El Rashedy AA, El Hefnawy M. Identifizierung neuartiger und wirksamer chemischer Verbindungen, die den Eintritt von Influenza- und Virusviren in vitro stören. Front Cell Infect Microbiol. 2017.

Hamouda RA, Abd El Maksoud AI, Wageed M, Alotaibi AS, Elebeedy D, Khalil H et al. Charakterisierung und Antikrebsaktivität von biosynthetisiertem Au/Cellulose-Nanokomposit aus Chlorella vulgaris. Polymere (Basel) [Internet]. 2021;13. Verfügbar unter: https://www.mdpi.com/2073-4360/13/19/3340.

Mohamed E-SA, Bassiouny K, Alshambky AA, Khalil H. Antikrebseigenschaften von N,N-Dibenzylasparagin als Asparagin (Asp)-Analogon unter Verwendung der Darmkrebs-Zelllinie Caco-2. J-Krebs im asiatisch-pazifischen Raum Zurück [Internet]. Abteilung für Molekularbiologie, Forschungsinstitut für Gentechnik und Biotechnologie, Universität Sadat City, 32897 Sadat City, Ägypten.; 2022;23:2531–40. Verfügbar unter: http://journal.waocp.org/article_90206.html.

El-Fadl HMA, Hagag NM, El-Shafei RA, Khayri MH, El-Gedawy G, Maksoud AIA, El et al. Effektive Bekämpfung von Raf-1 und der damit verbundenen Autophagie durch neuartige extrahierte Peptide zur Behandlung von Brustkrebszellen. Front Oncol [Internet]. 2021;11:3317. Verfügbar unter: https://www.frontiersin.org/article/https://doi.org/10.3389/fonc.2021.682596.

Elawdan KA, Farouk S, Aref S, Shoaib H, El-Razik MA, Abbas NH et al. Zusammenhang zwischen Vitamin B12/Ferritin-Mangel bei Krebspatienten mit methylomischen Veränderungen bei Promotoren der TET-Methylcytosin-Dioxygenasen. Biomark Med [Internet]. 2022;16:959–70. Verfügbar unter: https://doi.org/10.2217/bmm-2022-0158.

Abd El Maksoud AI, Taher RF, Gaara AH, Abdelrazik E, Keshk OS, Elawdan KA et al. Selektive Regulierung von B-Raf-abhängigem K-Ras/Mitogen-aktiviertem Protein durch natürlich vorkommende Multikinase-Inhibitoren in Krebszellen. Front Oncol [Internet]. Frontiers Media SA; 2019;9:1220. Verfügbar unter: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6861212/.

Taher RF, Al-Karmalawy AA, Abd El Maksoud AI, Khalil H, Hassan A, El-Khrisy E-DA et al. Zwei neue Flavonoide und Antikrebsaktivität von Hymenosporum flavum: In-vitro- und molekulare Docking-Studien. J Herbmed Pharmacol [Internet]. Shahrekord-Universität für medizinische Wissenschaften; 2021;10:443–58. Verfügbar unter: http://herbmedpharmacol.com/Article/jhp-39092.

Fekry Tarek S, Mohamed AE, Amal. Muawia Shaden NY und KH. Antikrebseigenschaften des mit Selen angereicherten Speise- und Heilpilzes Auster, Pleurotus ostreatus (Agaricomycetes), bei Darmkrebs in vitro. Int J Med Pilze. 2022;24:1–20.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Khalil H, Abd El Maksoud AI, Alian A, El-Hamady WA, Daif AA, Awad AM et al. Unterbrechung der Autophagosomenbildung bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen, ein Beweis für die schützende Reaktion der Autophagie. Immunol Invest [Internet]. Taylor & Francis; 2019 [zitiert am 16. Juli 2019];1–15. Verfügbar unter: https://www.tandfonline.com/doi/full/https://doi.org/10.1080/08820139.2019.1635619.

Rao X, Huang X, Zhou Z, Lin Biostat Bioinforma Biomath. 2013.

Khalil H, Arfa M, El-Masrey S, EL-Sherbini S, Abd-Elaziz A. Einzelnukleotidpolymorphismen von Interleukinen im Zusammenhang mit einer Hepatitis-C-Virusinfektion in Ägypten. J Dev Ctries infizieren. 2017;11:261–8.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Haque MM, Murale DP, Lee JS. Rolle von microRNA und oxidativem Stress bei der Pathogenese des Influenza-A-Virus. Int J Mol Sci. 2020;21:8962.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rosenberger CM, Podyminogin RL, Navarro G, Zhao GW, Askovich PS, Weiss MJ, et al. miR-451 reguliert die Zytokinreaktionen dendritischer Zellen auf eine Grippeinfektion. J Immunol. 2012;189:5965–75.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang X, Dong C, Sun X, Li Z, Zhang M, Guan Z, et al. Die Induktion des zellulären miR-29c durch das Influenzavirus hemmt die angeborene Immunantwort durch den Schutz der A20-mRNA. Biochem Biophys Res Commun. 2014;450:755–61.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lam WY, Yeung AC-M, Ngai KL-K, Li MS, To KF, Tsui SK-W et al. Auswirkung einer Vogelgrippe-A-H5N1-Infektion auf die Expression von microRNA-141 in menschlichen respiratorischen Epithelzellen. BMC Microbiol [Internet]. 2013;13:104. Verfügbar unter: https://doi.org/10.1186/1471-2180-13-104.

Velazquez-Salinas L, Verdugo-Rodriguez A, Rodriguez LL, Borca MV. Die Rolle von Interleukin 6 bei Virusinfektionen. Front Microbiol [Internet]. Frontiers Media SA; 2019;10:1057. Verfügbar unter: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31134045.

Wang Y, van Boxel-Dezaire AHH, Cheon H, Yang J, Stark GR. Die STAT3-Aktivierung als Reaktion auf IL-6 wird durch die Bindung des IL-6-Rezeptors an den EGF-Rezeptor verlängert. Proc Natl Acad Sci [Internet]. Verfahren der National Academy of Sciences; 2013;110:16975–80. Verfügbar unter: https://doi.org/10.1073/pnas.1315862110.

Brocke-Heidrich K, Kretzschmar AK, Pfeifer G, Henze C, Löffler D, Koczan D et al. Interleukin-6-abhängige Genexpressionsprofile in INA-6-Zellen des multiplen Myeloms zeigen einen von der Bcl-2-Familie unabhängigen Überlebensweg, der eng mit der Stat3-Aktivierung verbunden ist. Blut [Internet]. 2004;103:242–51. Verfügbar unter: https://doi.org/10.1182/blood-2003-04-1048.

Scheller J, Chalaris A, Schmidt-Arras D, Rose-John S. Die pro- und entzündungshemmenden Eigenschaften des Zytokins Interleukin-6. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res [Internet]. 2011;1813:878–88. Verfügbar unter: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167488911000425.

Vahey MD, Fletcher DA. Die Oberflächenproteine des Influenza-A-Virus sind so organisiert, dass sie beim Eindringen in den Wirtsschleim helfen. Chakraborty AK, Neher RA, Neher RA, Zanin M, Herausgeber. Elife [Internet]. eLife Sciences Publications, Ltd; 2019;8:e43764. Verfügbar unter: https://doi.org/10.7554/eLife.43764.

Raftery N, Stevenson NJ. Fortschritte in der antiviralen Immunabwehr: Aufdeckung der Bedeutung des IFN JAK/STAT-Signalwegs. Cell Mol Life Sci [Internet]. 2017;74:2525–35. Verfügbar unter: https://doi.org/10.1007/s00018-017-2520-2.

Sadler AJ, Williams BRG. Interferon-induzierbare antivirale Effektoren. Nat Rev Immunol. 2008;8:559–68.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schneider WM, Chevillotte MD, Rice CM, Interferon-Stimulated Genes. Ein komplexes Netz aus Host-Verteidigungen. Annu Rev Immunol [Internet]. Jahresrückblicke; 2014;32:513–45. Verfügbar unter: https://doi.org/10.1146/annurev-immunol-032713-120231.

Horisberger MA, Wathelet M, Szpirer J, Szpirer C, Islam Q, Levan G, et al. cDNA-Klonierung und Zuordnung zum Chromosom 21 des IFI-78K-Gens, dem menschlichen Äquivalent des murinen Mx-Gens. Somat Cell Mol Genet. 1988;14:123–31.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ji Z, Wang X, Liu X. NS1: Ein Schlüsselprotein im „Spiel“ zwischen Influenza-A-Virus und Wirt bei der angeborenen Immunität. Front Cell Infect Microbiol [Internet]. 2021;11. Verfügbar unter: https://www.frontiersin.org/articles/https://doi.org/10.3389/fcimb.2021.670177.

Lee MC, Yu CP, Chen XH, Liu MT, Yang JR, Chen AY et al. Das NS1-Protein des Influenza-A-Virus unterdrückt die antivirale Immunantwort, indem es NF-κB kapert, um die Transkription von Typ-III-IFN zu vermitteln. Front Cell Infect Microbiol [Internet]. 2022;12. Verfügbar unter: https://www.frontiersin.org/articles/https://doi.org/10.3389/fcimb.2022.998584.

Jureka AS, Kleinpeter AB, Tipper JL, Harrod KS, Petit CM. Das Influenza-NS1-Protein moduliert die RIG-I-Aktivierung über eine stammspezifische direkte Interaktion mit der zweiten CARD von RIG-I. J Biol Chem [Internet]. 2020;295:1153–64. Verfügbar unter: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0021925817499236.

Referenzen herunterladen

Open-Access-Finanzierung durch die Science, Technology & Innovation Funding Authority (STDF) in Zusammenarbeit mit der Egyptian Knowledge Bank (EKB).

Abteilung für Molekularbiologie, Forschungsinstitut für Gentechnik und Biotechnologie, Universität Sadat City, Sadat City, 79, Ägypten

Mai Alalem, Emad Dabous, Ahmed M. Awad, Nedaa Alalem, Adel A. Guirgis, Samir El-Masry und Hany Khalil

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Mai Alalem, Emad Dabous, Nedaa Alalem und Ahmed Awad führten die Experimente durch. Adel Guirgis und Samir El-Masry halfen bei der Überwachung und Konzeption der Experimente. Hany Khalil entwarf den Forschungsplan, leitete die Gesamtforschung, analysierte und interpretierte die Ergebnisse. Hany Khalil und Mai Alalem organisierten und verfassten das Manuskript.

Korrespondenz mit Hany Khalil.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Die vorliegende Studie wurde von der Ethikkommission des Forschungsinstituts für Gentechnik und Biotechnologie der Universität Sadat City, Ägypten, genehmigt. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und der Einreichung und Veröffentlichung zugestimmt.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Unten finden Sie den Link zum elektronischen Zusatzmaterial.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Der Creative Commons Public Domain Dedication-Verzicht (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) gilt für die in diesem Artikel zur Verfügung gestellten Daten, sofern in einer Quellenangabe für die Daten nichts anderes angegeben ist.

Nachdrucke und Genehmigungen

Alalem, M., Dabous, E., Awad, AM et al. Influenza-A-Virus reguliert die Interferon-Signalübertragung und die damit verbundenen Gene; MxA und STAT3 durch zelluläres miR-141, um die Virusreplikation sicherzustellen. Virol J 20, 183 (2023). https://doi.org/10.1186/s12985-023-02146-4

Zitat herunterladen

Eingegangen: 26. April 2023

Angenommen: 28. Juli 2023

Veröffentlicht: 18. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-023-02146-4

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt