Eine Omicron-Infektion nach der Impfung verstärkt ein breites Spektrum an Immunreaktionen, abhängig von der Infektionsgeschichte

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 5065 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die ausgeprägte Immunflucht der SARS-CoV-2-Omicron-Variante hat dazu geführt, dass viele Menschen eine hybride Immunität besitzen, die durch eine Kombination aus Impfung und Infektion entsteht. Es wurden Bedenken geäußert, dass Omicron-Durchbruchinfektionen bei dreifach geimpften Personen zu einer schlechten Induktion der Omicron-spezifischen Immunität führen und dass eine frühere SARS-CoV-2-Infektion mit einer Schwächung des Immunsystems verbunden ist. Mit einem breiten und umfassenden Ansatz charakterisieren wir die Schleimhaut- und Blutimmunität gegen Spike- und Nicht-Spike-Antigene nach BA.1/BA.2-Infektionen bei dreifach mRNA-geimpften Personen mit und ohne vorherige SARS-CoV-2-Infektion. Wir stellen fest, dass bei den meisten Individuen die BA.1/BA.2/BA.5-spezifischen neutralisierenden Antikörper nach einer Infektion ansteigen, bestätigen aber, dass das Ausmaß des Anstiegs und die Post-Omicron-Titer bei infektionsnaiven Personen höher sind. Im Gegensatz dazu ist unabhängig von der Infektionsgeschichte ein signifikanter Anstieg der nasalen Reaktionen, einschließlich der neutralisierenden Aktivität gegen den BA.5-Spike, zu beobachten. Spike-spezifische T-Zellen nehmen nur bei infektionsnaiven Geimpften zu; Die Post-Omicron-T-Zell-Antworten sind jedoch bei zuvor Infizierten deutlich höher, die nach der dritten mRNA-Impfstoffdosis eine maximal induzierte Reaktion mit einem hochzytotoxischen CD8+-Phänotyp zeigen. Die Reaktionen auf Nicht-Spike-Antigene nehmen unabhängig vom vorherigen Infektionsstatus deutlich zu. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die durch Omicron-Durchbruchinfektionen induzierte Hybridimmunität durch eine signifikante Immunverstärkung gekennzeichnet ist, die zum Schutz vor zukünftigen Omicron-Varianten beitragen kann.

Seit ihrer Erstbeschreibung im November 2021 hat sich die Variante B.1.1.529 (Omikron) des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) rasch auf der ganzen Welt verbreitet1,2. Seitdem sind mehrere Viren der Omicron-Linie aufgetaucht, wobei die Wellen zunächst von den Varianten BA.1 und BA.2 dominiert wurden, gefolgt von BA.4/5 und in jüngerer Zeit von Kombinationen von Omicron-Varianten wie BA.2.75, BQ.1 und XBB3. Die beispiellose Anzahl von Spike-Mutationen in Omicron-Viren hat zu einem erheblichen Entkommen der durch Impfstoffe und Infektionen verursachten Immunität geführt4,5. Die Wirksamkeit des Impfstoffs gegen eine symptomatische SARS-CoV-2-Infektion mit B.1.1.529 nach einer dritten BNT162b2-mRNA-Impfstoffdosis wird nach 2–4 Wochen auf 67,2 % geschätzt und sinkt nach 10 Wochen auf 45,7 %6. Infolgedessen verfügen viele Personen in stark geimpften Bevölkerungsgruppen mittlerweile über eine sogenannte Hybridimmunität, die durch eine Kombination aus Impfung und Infektion entsteht. Eine multiregionale Kohortenstudie in der Schweiz schätzte, dass bis Juli 2022 mindestens 51 % der Bevölkerung über eine Hybridimmunität verfügten, wobei 85 % über ein gewisses Maß an Omicron-spezifischer Antikörperimmunität verfügten7.

Bis zur weit verbreiteten Verbreitung von Omicron waren Personen mit hybrider Immunität vor allem diejenigen, die während der SARS-CoV-2 B.1.1.7/alpha- oder Prä-alpha-Welle („Vorfahren“) infiziert waren, bevor sie mit ihren Impfzyklen begannen. Diese „zuvor infizierten“ Personen zeigen nach jeder Impfdosis höhere Spike-spezifische Serumantikörper- und T-Zell-Reaktionen im Vergleich zu infektionsnaiven Geimpften8,9,10. Die durch Infektionen nach der Impfung hervorgerufene hybride Immunität kann sich quantitativ und qualitativ von den Reaktionen unterscheiden, die bei Personen beobachtet werden, bei denen vor der Impfung eine SARS-CoV-2-Infektion aufgetreten ist. Dies kann auf Unterschiede in der vorbereitenden SARS-CoV-2-Exposition oder auf eine geringere Antigenexposition während des abgeschwächten Krankheitsverlaufs von Omicron-Viren zurückzuführen sein; Allerdings ist es schwierig, die Beiträge der Veränderung des viralen Phänotyps von denen einer bereits bestehenden Immunität zu unterscheiden11. Jüngste Berichte deuten darauf hin, dass die Omicron-spezifische Immunität, die durch Durchbruchinfektionen erzeugt wird, bei dreifach geimpften Personen möglicherweise gedämpft ist, wobei Personen mit einer Vorgeschichte von SARS-CoV-2 aufgrund der Immunprägung aufgrund ihrer früheren Infektion besonders schlecht reagieren12. 13.

Wir haben eine umfassende Profilierung der zirkulierenden und mukosalen Immunität vor und nach Omicron BA.1- oder BA.2-Infektionen in einer Kohorte von dreifach geimpften Mitarbeitern des Gesundheitswesens an mehreren Standorten im Vereinigten Königreich durchgeführt, stratifiziert nach Personen mit einer Vorgeschichte von SARS-CoV- 2-Infektion und diejenigen, die infektionsnaiv waren. Wir stellen fest, dass die Reaktionen der SARS-CoV-2-spezifischen neutralisierenden Antikörper (NAb) auf eine Omicron-Infektion zwar bei Personen mit einer früheren SARS-CoV-2-Erkrankung tatsächlich geringer sind, was mit jüngsten Beobachtungen übereinstimmt, die Omicron-spezifische neutralisierende Aktivität bei den meisten Personen jedoch deutlich zunimmt. Spike-spezifische T-Zell-Reaktionen nehmen auch nur bei Personen ohne Vorgeschichte von SARS-CoV-2 zu, obwohl das Ausmaß dieser Reaktionen bei zuvor infizierten Personen nach einer Omicron-Infektion immer noch höher ist. Darüber hinaus kommt es unabhängig von der SARS-CoV-2-Vorgeschichte nach der Omicron-Behandlung zu einem Anstieg der sekretorischen IgA-Reaktionen in der Nasenschleimhautflüssigkeit, ebenso wie bei Antikörper- und T-Zell-Reaktionen auf Nicht-Spike-Ziele. Unsere Daten zeigen, dass eine frühere SARS-CoV-2-Infektionsgeschichte die Immunantwort so modulieren kann, dass sie bei einer Omicron-Infektion in geimpften Populationen ansteigt. Allerdings verstärkt eine Omicron-Infektion bei dreifach geimpften Personen im Allgemeinen die Immunantwort auf SARS-CoV-2 sowohl im Blut als auch in der Schleimhaut und trägt wahrscheinlich zur anhaltenden Immunität der Bevölkerung gegen COVID-19 bei.

In die Studie wurden 94 Personen aus vier Standorten (Liverpool, Newcastle, Oxford und Sheffield) mit einer SARS-CoV-2-Infektion einbezogen, die nach drei BNT162b2-mRNA-Impfstoffdosen auftraten, von denen 38 (40,4 %) eine Vorgeschichte von SARS hatten -CoV-2 vor Beginn der Impfung (Tabelle 1). Die mittlere Zeit von dieser ersten Infektion bis zur dritten Impfdosis betrug 544 Tage (IQR 514–559), wobei alle bis auf eine Infektion vor Dezember 2020 auftraten, als eine weitverbreitete Verbreitung von B.1.1.7/alpha-Varianten auftrat (Prä-Alpha/ Ahnen). Zuvor infizierte Personen waren etwas älter als unbedarfte medizinische Fachkräfte (Durchschnittsalter 48 vs. 41, p = 0,02, Tabelle 1), wobei der Anteil weiblicher Teilnehmer höher war (84,2 % vs. 58,9 %, p = 0,01). Alle Personen hatten ihre 1. und 2. Impfdosis im durchschnittlichen Abstand von 9,6 Wochen erhalten (IQR 8,9–10,9), entsprechend den Richtlinien der britischen Gesundheitsbehörde UK Health Security Agency (UKHSA), die das empfohlene Dosierungsintervall im Dezember von 3 Wochen auf bis zu 12 Wochen verlängerten 202114. Die Teilnehmer erhielten ihre 2. und 3. Impfdosis im Median im Abstand von 34,9 Wochen (IQR 32,4–37,4). Omicron-Infektionen ereigneten sich zwischen dem 21. Dezember 2021 und dem 17. Mai 2022, wobei Sequenzdaten von 29 % der in die Studie einbezogenen Personen zur Bestätigung der SARS-CoV-2-Abstammungslinie (17 BA.1 und 11 BA.2) verfügbar waren (Sequenzdaten wurden erhalten als). Teil der britischen Überwachung, wobei unser Zugang zu ihnen durch die Zustimmung der Teilnehmer abgedeckt ist). Unter der Annahme, dass Infektionen ab dem 20. März 2022 wahrscheinlich durch BA.215 verursacht wurden, wurden 62 (66 %) Infektionen als wahrscheinlich oder bestätigt BA.1 eingestuft (Tabelle 1). Ausführliche Informationen zu den eingeschlossenen Teilnehmern finden Sie in Tabelle 1.

Nach der dritten mRNA-Impfstoffdosis, aber vor der Omicron-Infektion, hatten Personen mit einer Vorgeschichte einer früheren SARS-CoV-2-Infektion (d. h. Hybridimmunität) signifikant höhere NAb-Titer (gemessen durch einen Lebendvirus-Neutralisationstest) gegen Vorfahren (S = 0,006), BA.1 (p = 0,04), BA.2 (p = 0,005) und BA.5 (p = 0,007) Viren als SARS-CoV-2-naive Mitarbeiter im Gesundheitswesen (Abb. 1a). Während das Plasma-Spike-spezifische IgG in beiden Gruppen gleich war, war das Plasma-Spike-spezifische IgA bei zuvor infizierten Personen höher als die Vorfahrenproteine ​​(p = 0,002), BA.2 (p = 0,01) und BA.5 (p = 0,03). (Abb. 1b, c), ebenso wie Plasma-Nukleokapsid-spezifisches IgG (p < 0,0001, Abb. 1d). Nur 13 von 38 (35,1 %) zuvor infizierten Personen hatten nachweisbares Nukleokapsid-spezifisches IgG im Plasma, was wahrscheinlich auf den Rückgang des Anti-N-IgG aufgrund der anfänglichen SARS-CoV-2-Infektion zurückzuführen ist, der fast ausschließlich in Prä-Alpha-Wellen auftrat. Beim Spike- oder Nukleokapsid-spezifischen sekretorischen IgA (sIgA) aus der Nasenschleimhautflüssigkeit (Abb. 1e, f) wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen zuvor infizierten und naiven Teilnehmern beobachtet, wobei die Aktivität des humanen Angiotensin-Converting-Enzyms 2 (ACE2) äquivalent war beide Gruppen gegen angestammte, BA.2- und BA.5-Spike-Proteine ​​(Abb. 1g). Periphere IFN-γ-T-Zell-Reaktionen waren bei zuvor infizierten Personen gegen Spike S1, S2 und kombinierte Membran- und Nukleokapsidpeptidpools signifikant höher (Abb. 1h–j), wie bereits gezeigt9.

Die Probenentnahme erfolgte im Median 32 Tage (IQR 28–42,3) nach der 3. mRNA-Dosis. a Lebendvirus-neutralisierende Aktivität des Plasmas gegen Vorfahrenviren, BA.1-, BA.2- und BA.5-Viren, ausgedrückt als Kehrwert der Verdünnung, die eine 50-prozentige Reduzierung der fokusbildenden Einheiten (FRNT50) zeigt; SARS-CoV-2-Spike-spezifisches Bindungs-IgG (b) und IgA (c) im Plasma gegen angestammte, BA.2- und BA.5-Spike-Proteine ​​(AU/ml = beliebige Antikörpereinheiten/ml im MesoScale Discovery (MSD)-Assay) ; d Nukleokapsid-spezifisches IgG im Plasma, bestimmt durch ELISA und ausgedrückt in Einheiten der WHO International, BAU/ml; Sekretorisches IgA (sIgA) in der Nasenschleimhautflüssigkeit, das auf (e) angestammte, BA.1-, BA.2- und BA.4-Spike-Proteine ​​und f-Nukleokapsid-spezifisches sIgA abzielt, ausgedrückt als Fläche unter der Kurve (AUC), normalisiert auf Gesamt-sIgA; g Fähigkeit der Nasenschleimhautflüssigkeit, die Bindung von ACE2 an die Spike-Proteine ​​BA.2 und BA.5 der Vorfahren zu hemmen, bewertet durch MSD-Assay; IFN-γ-ELISpot-Antworten auf überlappende Peptidpools, die die S1 (h)- und S2 (i)-Spike-Untereinheiten der Ahnenviren, BA.1- und BA.2-Viren sowie ja einzelne Pool-haltige Peptide beider Ahnenmembranen (M) darstellen. und Nukleokapsid (N)-Proteine. Die Ergebnisse werden als fleckbildende Einheiten pro Million Zellen (SFU/106) ausgedrückt. Die gestrichelte Linie stellt einen Positivitätsschwellenwert des Mittelwerts + 2 SD der Hintergrundreaktion dar. Die Daten werden mit Medianwert und Interquartilbereich angezeigt. Es wird der mittlere Faltungsunterschied zwischen infektionsnaiven und zuvor infizierten Personen angezeigt. Alle Vergleiche wurden mit dem zweiseitigen Mann-Whitney-U-Test durchgeführt. p-Werte werden angezeigt, wenn <0,05. Für a–d wurden die Reaktionen von 53 SARS-CoV-2-naiven und 37 zuvor infizierten Personen ausgewertet, von denen Proben verfügbar waren. Beispielsweise wurden die Reaktionen von 32 SARS-CoV-2-naiven und 19 zuvor infizierten Personen ausgewertet, von denen Proben verfügbar waren. Für h–j wurden die Reaktionen von 37 SARS-CoV-2-naiven und 32 zuvor infizierten Personen ausgewertet, von denen Proben verfügbar waren. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die mittlere Zeit von der dritten mRNA-Impfstoffdosis bis zur Omicron-Infektion betrug 140 Tage (IQR 90–167, Tabelle 1) und unterschied sich nicht signifikant zwischen SARS-CoV-2-naiven und zuvor infizierten Personen (p = 0,55). Nach einer Omicron-Infektion wurde bei zuvor SARS-CoV-2-naiven Personen ein signifikanter Anstieg der Neutralisierungsfähigkeit des Plasma-Ahnenvirus beobachtet (2,2-fach, p < 0,0001), nicht jedoch bei zuvor infizierten Mitarbeitern im Gesundheitswesen (1,0-fach, p = 0,71). , Abb. 2a). Ein viel stärkerer Anstieg der neutralisierenden Aktivität wurde in der zuvor mit Omicron BA.1 naiven Gruppe beobachtet (7,3-fach, p < 0,0001), BA.2 (5,8-fach, p < 0,0001) und BA.5 (8,1-fach). , p < 0,0001) Viren. Auch zuvor infizierte Personen verzeichneten nach der Infektion einen Anstieg der NAbs gegen Omicron-Varianten, wenn auch in geringerem Ausmaß (BA.1, 1,7-fach, p = 0,002; BA.2, 1,4-fach, p = 0,002; BA.5, 1,6-fach, p = 0,007). Die neutralisierenden Titer nach der Infektion für alle getesteten Varianten waren bei den zuvor naiven Personen signifikant höher als bei Personen mit einer Vorgeschichte von SARS-CoV-2 (Abb. 2a). In den einzelnen Plasma-NAb-Trajektorien zu BA.1, BA.2 und BA.5 war eine signifikante Heterogenität erkennbar (Abb. 2b), wobei in beiden Gruppen Antikörper-Responder und Non-Responder beobachtet wurden. Ein NAb-Anstieg (definiert als Faltdifferenz >1,0) wurde bei 49/53 naiven Personen gegenüber BA.1, 50/53 bei BA.2 und 52/53 bei BA.5 beobachtet, im Vergleich zu NAb-Anstiegen bei 26/53. 37 zuvor infizierte Personen. Der Fold-Change von der Prä- zur Post-Omicron-Infektion lag bei naiven Personen im Bereich von 0,44× bis 29,3× gegen SARS-CoV-2 der Vorfahren und im Bereich von 0,51× bis 156,4× gegen Omicron-Subvarianten, während der Fold-Change bei der zuvor infizierten Person im Bereich von 0,44× bis 29,3× lag von 0,50× bis 4,9× gegen das Ahnenvirus und von 0,19× bis 16,4× gegen Omicron-Subvarianten.

a Lebendvirus-neutralisierende Aktivität des Plasmas gegen Vorfahrenviren, BA.1-, BA.2- und BA.5-Viren, ausgedrückt als Kehrwert der Verdünnung, die eine 50-prozentige Reduzierung der fokusbildenden Einheiten (FRNT50) zeigt; b Paarweise Darstellung von Prä- und Post-Omicron-FRNT als individuelle Teilnehmertrajektorien für BA.1-, BA.2- und BA.5-neutralisierende Antikörper; c Nukleokapsid-spezifisches IgG im Plasma, bestimmt durch ELISA und ausgedrückt in Einheiten der WHO International, BAU/ml; SARS-CoV-2-Spike-spezifisches Bindungs-IgG (d) und IgA (e) im Plasma gegen angestammte, BA.2- und BA.5-Spike-Proteine ​​(AU/ml = beliebige Antikörpereinheiten/ml im MSD-Assay). Die Daten werden mit Medianwert und Interquartilbereich angezeigt. Dargestellt ist der mittlere Fold-Change von vor und nach der Infektion. Statistische Vergleiche gepaarter Proben vor und nach der Infektion, die mit dem zweiseitigen Wilcoxon-Signed-Rank-Test erstellt wurden, und zwischen Post-Infektionswerten bei zuvor infizierten und SARS-CoV-2-naiven Personen, die mit dem zweiseitigen Mann-Whitney-U.-Test erstellt wurden -prüfen. P-Werte werden angezeigt, wenn <0,05. Die Reaktionen wurden bei 53 SARS-CoV-2-naiven und 37 zuvor infizierten Personen ausgewertet, von denen Proben verfügbar waren. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Das Plasma-Anti-Nukleokapsid-IgG stieg in beiden Gruppen nach der Infektion an, obwohl im Gegensatz zu den Neutralisierungsdaten die Post-Infektionswerte bei den zuvor infizierten Personen signifikant höher waren als bei denen, die vor der Omicron-Infektion SARS-CoV-2-naiv waren (S < 0,0001, Abb. 2c). Alle zuvor infizierten Personen hatten jetzt nachweisbares Anti-Nukleokapsid-IgG, verglichen mit 41/53 (77,4 %) der zuvor unbehandelten Mitarbeiter im Gesundheitswesen.

Die Anti-Spike-bindenden IgG-Spiegel im Plasma folgten einem ähnlichen Muster wie die NAb-Daten bei zuvor unbehandelten Individuen, wobei nach der Infektion ein Anstieg der angestammten Spike-Proteine ​​BA.2 und BA.5 zu beobachten war und die Post-Infektions-Spiegel nun deutlich höher waren diese Personen im Vergleich zu denen mit früherem SARS-CoV-2 (Abb. 2d). In der zuvor infizierten Gruppe waren die Anti-Spike-IgG-Spiegel gegen alle Proteine ​​nach der Infektion etwas niedriger als nach der dritten Dosis (Vorfahren, 0,8-fach, p = 0,007; BA.2, 0,8-fach, p = 0,09). ; BA.5, 0,8-fach, p = 0,01), obwohl dieser Vergleich kein Nachlassen der Reaktionen berücksichtigt, die nach Dosis 3, aber vor der Omicron-Infektion auftraten. Im Gegensatz dazu stieg das Plasma-Anti-Spike-bindende IgA nach der Infektion in beiden Gruppen an (Abb. 2e), allerdings wiederum in einem größeren Ausmaß bei zuvor naiven Gruppen (Vorfahren, 5,0-fach, p < 0,0001; BA.2, 6,6-fach, p < 0,0001; BA.5, 5,5-fach, p < 0,0001) im Vergleich zu zuvor infizierten Personen (Vorfahren, 1,5-fach, p = 0,03; BA.2, 1,7-fach, p = 0,01; BA.5, 1,5). -fach, p = 0,01). Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Stratifizierung der Teilnehmer nach wahrscheinlichen BA.1- oder BA.2-Infektionen beobachtet (Abb. S1).

Das nasale Spike-spezifische sIgA stieg nach einer Omicron-Infektion sowohl bei SARS-CoV-2-naiven als auch bei zuvor infizierten Personen signifikant an (Abb. 3a). Das Ausmaß des Anstiegs war bei den verschiedenen getesteten Proteinen ähnlich; 11,4- bis 16,5-facher Anstieg bei SARS-CoV-2-naiven Personen und 10,6-facher bis 14,8-facher Anstieg bei zuvor infizierten Personen, ohne statistisch signifikante Unterschiede in den Post-Infektionswerten zwischen den beiden Gruppen. In ähnlicher Weise stieg auch das nasale Nukleokapsid-spezifische sIgA nach einer Omicron-Infektion sowohl bei SARS-CoV-2-naiven (3,1-fach, p = 0,003) als auch bei zuvor infizierten (2,9-fach, p = 0,0002) Beschäftigten im Gesundheitswesen signifikant an (Abb. 3b). . Die Fähigkeit der Nasenschleimhautflüssigkeit, die Bindung von ACE2 an das Spike-Protein der Vorfahren zu hemmen (Ersatzneutralisationstest), war nach der Infektion bei zuvor unbehandelten Personen signifikant erhöht (p = 0,003), nicht jedoch bei Personen mit einer Vorgeschichte von SARS-CoV-2 (p = 0,95; Abb. 3c). Im Gegensatz dazu wurde in beiden Gruppen ein signifikanter Anstieg der Hemmung der ACE2-Bindung an die Spike-Proteine ​​BA.2 und BA.5 beobachtet (Abb. 3c). Beachten Sie, dass der p-Wert = 0,0425 ist, obwohl die fache Änderung von Prä- zu Post-Omikron gegenüber BA.2 in der zuvor infizierten Gruppe 1,0× beträgt; Dies ist auf die Verwendung der mittleren Faltungsänderung zur Berechnung der Statistik zurückzuführen.

Sekretorisches IgA (sIgA) in der Nasenschleimhautflüssigkeit, das auf ein Vorfahren-, BA.1-, BA.2- und BA.4-Spike-Protein und b-Nukleokapsidprotein abzielt, ausgedrückt als Fläche unter der Kurve (AUC), normalisiert auf Gesamt-sIgA; c Fähigkeit der Nasenschleimhautflüssigkeit, die Bindung von ACE2 an die Spike-Proteine ​​BA.2 und BA.5 der Vorfahren zu hemmen, ermittelt durch MSD-Assay. Die Daten werden mit Medianwert und Interquartilbereich angezeigt. Dargestellt ist der mittlere Fold-Change von vor und nach der Infektion. Statistische Vergleiche gepaarter Proben vor und nach der Infektion, die mit dem zweiseitigen Wilcoxon-Signed-Rank-Test erstellt wurden, und zwischen Post-Infektionswerten bei zuvor infizierten und SARS-CoV-2-naiven Personen, die mit dem zweiseitigen Mann-Whitney-U.-Test erstellt wurden -prüfen. p-Werte werden angezeigt, wenn <0,05. Die Reaktionen wurden bei 32 SARS-CoV-2-naiven und 19 zuvor infizierten Personen ausgewertet, von denen Proben verfügbar waren. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Bei SARS-CoV-2-naiven Personen wurde nach einer Omicron-Infektion ein signifikanter Anstieg der peripheren IFN-γ-ELISpot-Reaktionen auf Peptidpools beobachtet, die S1 der Vorfahren repräsentieren (1,9-fach, p < 0,0001) und S2 (1,8-fach, p = 0,002). , BA.1 S1 (2,7-fach, p < 0,0001) und S2 (2,2-fach, p = 0,0006) und BA.2 S1 (2,6-fach, p < 0,0001) und S2 (1,8-fach, p = 0,002). ; Abb. 4a, b). Bei Personen mit einer früheren SARS-CoV-2-Infektion wurde nach Omicron kein Anstieg beobachtet. Im Gegensatz zu plasmaneutralisierenden Antikörpern waren die S1-spezifischen T-Zell-Reaktionen nach Omicron jedoch immer noch signifikant höher als bei zuvor naiven Personen für Vorfahren ( p = 0,003), BA.1 (p = 0,004) und BA.2 (p = 0,01) Peptidpools (Abb. 4a). Im Gegensatz zu Spike-Reaktionen nahmen die T-Zell-Reaktionen auf einen Membran- und Nukleokapsidpeptidpool sowohl bei SARS-CoV-2-naiven (11,8-fach, p < 0,0001) als auch bei zuvor infizierten (2,0-fach, p = 0,0004) Personen zu. wobei die Post-Omicron-Spiegel in der letzteren Gruppe nach einem Boost auf zuvor vorbereitete T-Zellen, die auf diese Nicht-Spike-Antigene abzielen, deutlich höher waren (p = 0,005, Abb. 4c). Signifikanter Anstieg der ELISpot-Antworten auf Peptidpools, die angestammte nichtstrukturelle Proteine ​​(NSP)1-2 (2,4-fach, p = 0,002), NSP4-6 (2,5-fach, p = 0,02), NSP7-11 (1,6-fach) repräsentieren , p = 0,002) und NSP12 (1,6-fach, p = 0,04) wurden bei SARS-CoV-2-naiven Personen nach einer Omicron-Infektion beobachtet (Abb. S2), obwohl die Gesamtreaktionen in jedem Pool niedrig waren und oft unter der Positivitätsschwelle blieben . Eine Omicron-Infektion führte zu einem signifikanten Anstieg eines Peptidpools, der den NSP3-Aminosäuren 663–1945 entspricht, sowohl bei naiven (2,9-fach, p = 0,0008) als auch bei zuvor infizierten (2,6-fach, p = 0,0006) Personen (Abb. S2).

IFN-γ-ELISpot-Reaktionen auf überlappende Peptidpools, die die Spike-Untereinheiten S1 (a) und S2 (b) der Vorfahren-, BA.1- und BA.2-Viren repräsentieren, und einen einzelnen Pool, der Peptide sowohl der Vorfahrenmembran (M) als auch der Vorfahrenviren enthält Nukleokapsid (N)-Proteine. Die Ergebnisse werden als fleckbildende Einheiten pro Million Zellen (SFU/106) ausgedrückt. Die gestrichelte Linie stellt einen Positivitätsschwellenwert des Mittelwerts + 2 SD der Hintergrundreaktion dar. Die Daten werden mit Medianwert und Interquartilbereich angezeigt. Dargestellt ist der mittlere Fold-Change von vor und nach der Infektion. Statistische Vergleiche gepaarter Proben vor und nach der Infektion, die mit dem zweiseitigen Wilcoxon-Signed-Rank-Test erstellt wurden, und zwischen Post-Infektionswerten bei zuvor infizierten und SARS-CoV-2-naiven Personen, die mit dem zweiseitigen Mann-Whitney-U.-Test erstellt wurden -prüfen. p-Werte werden angezeigt, wenn <0,05. Die Reaktionen wurden bei 37 SARS-CoV-2-naiven und 32 zuvor infizierten Personen ausgewertet, von denen Proben verfügbar waren. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Eine Hauptkomponentenanalyse wurde durchgeführt, um die Heterogenität der SARS-CoV-2-Immunität zu untersuchen, indem die Prä- und Post-Omicron-Schleimhaut- und Blutimmunreaktionen bei den 94 in die Studie einbezogenen Personen integriert wurden (Abb. 5). 44,6 % der in den ersten beiden Dimensionen (PC1 und PC2) beobachteten Varianz konnten durch die gemessenen immunologischen Parameter erklärt werden. Die Omicron-Infektion war ein Hauptgrund für die Trennung in den Daten, obwohl es erhebliche Unterschiede in der Auswirkung von Omicron zwischen den einzelnen Personen gab (Abb. 5a). Der vorherige Infektionsstatus hatte ebenfalls einen großen Einfluss auf die Trennung in den Daten, obwohl es wiederum erhebliche Überschneidungen zwischen den einzelnen Personen gab (Abb. 5b). Es wurden zwei unterschiedliche Immunitätsmuster beobachtet, die entweder durch Plasmabindung und NAb-Reaktionen (Abb. 5c, unterer rechter Quadrant, stark korreliert mit Dimension 1) oder durch T-Zell-Reaktionen (Abb. 5c, oberer rechter Quadrant, stark korreliert mit Dimension) gesteuert werden 2; Abb. 5d). Plasma-Antikörper- und Blut-T-Zell-Reaktionen waren die wichtigsten Faktoren für die immunphänotypische Variabilität, während Variablen wie Alter oder Zeit zwischen der 3. Impfdosis und der Omicron-Infektion nur sehr wenig zur Variation in unseren Daten beitrugen (Abb. 5e).

PCA-Diagramm, das integrierte immunologische Daten darstellt, die Komponenten 1 (PC1) und 2 (PC2) darstellen, kommentiert durch Proben von Prä- und Post-Omicron-Infektionen (a) und von SARS-CoV-2-naiven und zuvor infizierten Personen (b). Prozentsätze geben die durch PC1 und PC2 erklärte Varianz an. c Variablenkorrelationsdiagramm, in dem positiv korrelierte Immunantworten gruppiert werden und negativ korrelierte Variablen in gegenüberliegenden Quadranten gefunden werden. Die Farbe gibt die Qualität der Darstellung der Variablen auf der Hauptkomponente (cos2) an, wobei ein höherer cos2 einer besseren Darstellung entspricht. d Qualität der durch cos2 gefärbten Variablendarstellungen und Beiträge der Variablen zu PC1 und PC2 (Größe des Kreises, größerer Kreis = größerer Beitrag). e Alle im PCA enthaltenen Variablen, geordnet nach Darstellungsgrad auf PC1 und PC2 (cos2).

Angesichts der Unterschiede in den T-Zell-Reaktionen, die zwischen SARS-CoV-2-naiven und zuvor infizierten Mitarbeitern des Gesundheitswesens vor und nach der Omicron-Infektion beobachtet wurden, sowie der unterschiedlichen Reaktionsmuster auf Spike- und Nicht-Spike-Proteine, wurde eine detaillierte phänotypische Charakterisierung von SARS durchgeführt -CoV-2-Epitop-spezifische CD8+-T-Zellen wurden mithilfe der Major Histocompatibility Complex (MHC)-Klasse-I-Peptid-Multimer-Färbung und Multiparameter-Durchflusszytometrie durchgeführt. Immundominanter Spike (A*01:01, A*02:01, A*03:01, B*57:01) und nicht-Spike (A*01:01 NSP3, B*07:02 Nukleokapsid) epitopspezifisches CD8+ T-Zellen wurden zusammen mit Cytomegalovirus (CMV)- und Epstein-Barr-Virus (EBV)-spezifischen CD8+-Populationen als Kontrollen charakterisiert. In Übereinstimmung mit den IFN-γ-ELISpot-Antworten nahm die Stärke der Spike-spezifischen CD8+-T-Zellen nach einer Omicron-Infektion bei SARS-CoV-2-naiven (p = 0,02), aber nicht zuvor infizierten Personen zu, wohingegen Nicht-Spike-Populationen signifikant zunahmen Beide Gruppen (p = 0,002 und p = 0,001; Abb. 6a, b), obwohl diese Anstiege in einigen Fällen relativ gering waren. Es wurden keine Veränderungen in EBV- oder CMV-spezifischen CD8+ T-Zellen beobachtet.

a Ausmaß multimerspezifischer CD8+-T-Zellen, ausgedrückt als % der gesamten CD8+-Zellen nach mRNA-Impfstoffdosis 3 (Prä-Omicron) und nach Omicron-Infektion (gepoolte Daten aus Sheffield und Newcastle). Dargestellt sind 63 Spike-spezifische Multimer-Populationen von 45 Individuen (23 naive, 22 zuvor infizierte), 24 Nicht-Spike-Populationen von 20 Individuen (10 naive, 10 zuvor infizierte), 15 CMV-spezifische Populationen von 15 Individuen und 41 EBV-spezifische Populationen von 32 Personen. Für die Anzeige auf einer log10-Achse wird negativen Proben ein Wert von 0,0001 % zugewiesen. b Repräsentative Durchflusszytometriediagramme, die multimerspezifische Spike- und Nicht-Spike-CD8+-Populationen von naiven und zuvor infizierten Personen vor und nach der Omicron-Infektion zeigen. Die Daten werden mit Medianwert und Interquartilbereich angezeigt. Statistische Vergleiche gepaarter Proben vor und nach der Infektion, sofern verfügbar, von denselben Teilnehmern wurden mit dem zweiseitigen Wilcoxon-Signed-Rank-Test und zwischen ungepaarten Gruppen unter Verwendung des Kruskal-Wallis-Tests mit Dunns Post-hoc-Test für mehrere paarweise Vergleiche durchgeführt. p-Werte sind >0,05, sofern sie nicht angezeigt werden. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Epitopspezifische T-Zellen wurden wie zuvor beschrieben in verschiedene Gedächtnisphänotypen eingeteilt, wobei Kombinationen aus CD45RO-, CCR7-, CD28- und CD95-Expression in naives (TNV), Stammzellgedächtnis (TSCM), zentrales Gedächtnis (TCM) und Übergangsgedächtnis (TTM) verwendet wurden. , Effektor-Gedächtnis- (TEM) und Terminal-Effektor-T-Zellen (TTE)16. Nach der dritten mRNA-Impfstoffdosis, aber vor der Omicron-Infektion, zeigten Spike-spezifische CD8+-T-Zellen bei zuvor infizierten Personen niedrigere TNV-Phänotypen (p = 0,0027) und höhere TEM-Phänotypen (p = 0,016) als Nicht-Spike-CD8+-T-Zellen ( Abb. S3). Die Visualisierung von Zellclustern mithilfe von UMAP-Diagrammen (Uniform Manifold Approximation and Projection) zeigte unterschiedliche Populationen von CMV- und EBV-spezifischen Zellen, wobei eine gewisse Trennung von SARS-CoV-2-spezifischen CD8+-T-Zellclustern durch Unterschiede in den Expressionsniveaus mehrerer Marker verursacht wurde , einschließlich CD57 und PD-1, die in Spike-spezifischen Zellen stärker exprimiert werden als in nicht-Spike-spezifischen Zellen, CD127, das in nicht-Spike-spezifischen Zellen stärker exprimiert wird, und Granzym B, das in stark exprimiert wird zuvor infizierte, aber nicht naive Personen, unabhängig vom Epitop (Abb. S4).

Der Phänotyp der Spike-spezifischen CD8+-T-Zellen veränderte sich von vor bis nach der Omicron-Infektion weder bei zuvor naiven noch bei infizierten Personen signifikant (Abb. 7a; S5 und S6). Dennoch wurden wesentliche Unterschiede zwischen den beiden Gruppen festgestellt: Spike-spezifische CD8+-Populationen bei zuvor infizierten Personen zeigten weniger TCM- und TTM-T-Zellen und einen terminaleren Effektor-Phänotyp als naiv geimpfte Personen, selbst nach einer Omicron-Infektion (p = 0,0017, Abb. 7a) sowie geringere Werte der CD27- und CCR2-Expression als in der naiven Gruppe (Abb. S5 und S6). Nicht-Spike-CD8+-Populationen bei zuvor infizierten Personen bestanden nach der Omicron-Infektion aus weniger Zellen mit einem TNV-Phänotyp (p = 0,023, Abb. 7b). Diese geboosterten CD8+-T-Zellen zeigten auch eher einen terminalen Effektor-Phänotyp als neu geprimte Nicht-Spike-Populationen in der zuvor naiven Gruppe (p = 0,040, Abb. 7b), mit geringerem CCR7, aber höherer Granzym-B-Expression, die in beobachtet wurde die Naiven (Abb. S5 und S6). Wir sahen auch Unterschiede zwischen den beiden Gruppen, wobei CCR2 bei naiven Teilnehmern stärker auf CD8+ T-Zellen exprimiert wurde, während CD57 und CD38 bei Teilnehmern mit einer Vorgeschichte früherer Infektionen stärker exprimiert wurden (Abb. S5 und S6). Die Expression des zytolytischen Enzyms Granzym B in Spike-spezifischen CD8+ T-Zellen veränderte sich nach der Omicron-Infektion nicht signifikant, allerdings waren die Expressionsniveaus bei zuvor infizierten Personen zu beiden Zeitpunkten signifikant höher (p = 0,0002 und p = 0,0042, Abb. 7c). ), auf ein ähnliches Niveau wie bei CMV-spezifischen T-Zellen.

a Gedächtnisphänotypen von Spike-spezifischen CD8+ T-Zellen bei 11 SARS-CoV-2-naiven und 14 zuvor infizierten Personen (gepoolte Daten aus Sheffield und Newcastle). b Gedächtnisphänotypen von CD8+-T-Zellen ohne Spike bei 7 SARS-CoV-2-naiven und 10 zuvor infizierten Personen (gepoolte Daten aus Sheffield und Newcastle). c Granzyme B-Expression in epitopspezifischen CD8+ T-Zellen (Daten von Sheffield). Dargestellt sind Spike-spezifische Populationen von 8 naiven und 12 zuvor infizierten Personen, Nicht-Spike-Populationen von 6 naiven und 8 zuvor infizierten Personen sowie CMV- und EBV-spezifische Populationen von 8 bzw. 5 Personen. Die Daten werden mit Medianwert und Interquartilbereich angezeigt. Statistische Vergleiche gepaarter Proben vor und nach der Infektion, sofern verfügbar, von denselben Teilnehmern wurden mit dem zweiseitigen Wilcoxon-Signed-Rank-Test und zwischen ungepaarten Gruppen unter Verwendung des Kruskal-Wallis-Tests mit Dunns Post-hoc-Test für mehrere paarweise Vergleiche durchgeführt. p-Werte sind >0,05, sofern sie nicht angezeigt werden. TNV-naive T-Zellen, TSCM-Stammzell-Gedächtnis-T-Zellen, TCM-Zentral-Gedächtnis-T-Zellen, TTM-Übergangsgedächtnis-T-Zellen, TEM-Effektor-Gedächtnis-T-Zellen, TTE-terminale Effektor-T-Zellen. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

In Ländern mit hohen SARS-CoV-2-Impfraten hat das Auftreten von Viren der Omicron-Linie mit erheblicher Immunflucht vor impfinduzierten NAbs zu hohen Infektionsraten und anschließender Hybridimmunität geführt. Die Natur dieser Post-Omikron-Immunität wurde durch neuere Erkenntnisse vor allem auf zwei Arten in Frage gestellt12,13. Erstens wurde vermutet, dass die relativ abgeschwächte Natur von Omicron-Infektionen11 zu einer schlechten Induktion von Immunantworten führt, und zweitens, dass die „Prägung“ einer früheren SARS-CoV-2-Infektion (z. B. mit Ahnen- oder Alphaviren) zu einer tiefgreifenden Immunreaktion führt. Dämpfung; Beide Szenarien schließen die Entstehung einer Omicron-spezifischen Immunität aus, die vor zukünftigen Omicron-Infektionen schützen kann. Diese Bedenken wurden auf der Grundlage von Daten geäußert, die sich hauptsächlich auf zirkulierende NAbs konzentrierten, die durch Spike-spezifische Reaktionen vermittelt werden. Wir haben einen breiteren Ansatz gewählt und die mukosale und zirkulierende Immunität gegen Spike- und Nicht-Spike-Antigenziele charakterisiert. Während wir einige der zuvor gemeldeten NAb-Daten replizieren, zeigen wir auch, dass Omicron-Infektionen zu einem signifikanten Anstieg von Schleimhautantikörpern und zirkulierenden T-Zellen führen, wobei die dominanten Antigenziele einiger Reaktionen von der Vorgeschichte einer SARS-CoV-2-Infektion abhängen.

Wir und andere haben wiederholt gezeigt, dass Personen mit einer SARS-CoV-2-Vorgeschichte vor der ersten mRNA-Impfung im Vergleich zu infektionsnaiven Personen nach jeder SARS-CoV-2-Impfstoffdosis höhere NAb-Titer aufweisen8,9,10. Dieser Vorteil verschwindet unmittelbar nach der Omicron-Infektion bei dreifach geimpften Erwachsenen, wobei Omicron-spezifische NAbs bei zuvor unbedarften Mitarbeitern im Gesundheitswesen einen größeren Schub erfahren. Dieser unerwartete Befund bei dreifach geimpften Personen wurde erstmals von Reynolds et al.13 berichtet, die feststellten, dass die Post-Omicron-NAb-Titer bei 11 zuvor unbehandelten Mitarbeitern im Gesundheitswesen signifikant höher waren als bei 6 Personen mit einer Vorgeschichte einer Infektion mit Prä-Alpha-SARS -CoV-2-Viren. Unsere größere Kohorte bestätigt diesen Befund, zeigt aber auch eine deutlich größere Heterogenität: 70 % der zuvor infizierten Personen erhöhten die Omicron-spezifischen NAb-Titer als Reaktion auf eine BA.1- oder BA.2-Infektion. Eine Studie mit 56 dreifach geimpften Beschäftigten im Gesundheitswesen in Schweden zeigte außerdem, dass die Post-Omicron-IgG- und NAb-Spiegel bei zuvor unbehandelten Personen höher waren als bei Personen mit einer Vorgeschichte einer SARS-CoV-2-Infektion12. Wichtig ist, dass die Omicron-spezifische Antikörperimmunität in beiden Gruppen immer noch höher war als bei Mitarbeitern im Gesundheitswesen, die kein bahnbrechendes Omicron hatten. Mehrere andere Studien haben bestätigt, dass Omicron-Infektionen bei zuvor nicht vorbehandelten, dreifach geimpften Erwachsenen die Omicron-spezifische NAb-Aktivität erhöhen17, vor allem durch die Expansion von Gedächtnis-B-Zellen gegen Epitope, die über Varianten hinweg konserviert sind.

Der Mechanismus hinter der relativ schlechten Induktion zirkulierender NAbs durch eine Omicron-Infektion bei dreifach geimpften, zuvor infizierten Personen bleibt ungeklärt. Als mögliche Erklärung wurde die Prägung oder die ursprüngliche Antigensünde (OAS) durch frühere Infektionen vorgeschlagen13. Das Konzept der OAS wurde erstmals für Influenza-Antikörper beschrieben18, wobei in neueren Arbeiten ein Einfluss früherer Influenza-Infektionen auf die Immunantwort nach einer nachfolgenden Influenza-Infektion und Impfung festgestellt wurde19,20,21. Es kommt zu OAS durch Antikörper, die durch frühere saisonale OC43/HKU1-Coronavirus-Infektionen erzeugt wurden; und tritt nach einer SARS-CoV-2-Infektion stärker auf als nach der ersten mRNA-Impfstoffdosis, wobei eine SARS-CoV-2-Infektion zu einem Anstieg von Antikörpern mit geringerer Affinität führt22. Es wurde auch eine potenziell vorteilhafte Prägung beschrieben; Omicron-Durchbruchinfektionen bei infektionsnaiven geimpften Personen induzieren Antikörper von B-Zellen, die mit Rezeptorbindungsdomänen mehrerer Varianten kreuzreagieren und eine größere Bandbreite an schützender Immunität bieten, wohingegen Antikörper nach primären Omicron-Infektionen bei infektionsnaiven ungeimpften Personen viel schmaler sind Spezifität17. Bemerkenswert ist, dass wir keine Verstärkung der NAbs gegen einen Stammstamm von SARS-CoV-2 auf Kosten der Erzeugung einer Omicron-spezifischen Immunität beobachten konnten. Wichtig ist, dass selbst Personen mit einer früheren Infektion einen viel größeren Anstieg der BA.1/BA.2/BA.5-NAb-Aktivität aufwiesen als beim Stamm der Vorfahren. Während es wahrscheinlich ist, dass konservierte Epitope zwischen Vorfahren- und Omicron-Viren gegenüber Omicron-spezifischen Epitopen bevorzugt verstärkt wurden, ist es unwahrscheinlich, dass OAS allein die von uns beobachtete abgeschwächte Reaktion bei zuvor infizierten Personen vollständig erklärt.

Eine weitere Hypothese ist, dass die höhere Omicron-spezifische Immunität nach der dritten mRNA-Impfstoffdosis, die bei Personen mit einer vorherigen SARS-CoV-2-Infektion beobachtet wird, zu einer geringeren Viruslast und damit zu einer geringeren Antigenexposition während einer Omicron-Infektion führen kann, was zu einer gedämpften Immuninduktion führt. Während Blom et al.12 einen Zusammenhang zwischen den Zyklusschwellenwerten (Ct) und den NAb-Werten fanden, unterschieden sich die Nadir-Ct-Werte (d. h. die höchsten Viruslasten) nicht zwischen unbehandeltem und zuvor infiziertem medizinischem Personal. Die Virusmenge bei zuvor infizierten Personen in unserer Studie reichte sicherlich aus, um einen signifikanten Anstieg von Non-Spike-Antikörpern und T-Zellen zu erzeugen; Dies schließt jedoch nicht aus, dass die Antigenlast in dieser Gruppe geringer war, was sich auf die beobachtete Post-Omicron-Immunität auswirkte. Schließlich ist es möglich, dass Unterschiede im Spike-spezifischen B-Zell-Phänotyp der Variabilität der NAb-Reaktion auf eine Omicron-Infektion zugrunde liegen könnten. Es wurde über einen Zusammenhang zwischen der Häufigkeit von CD27lo-B-Zellen und einer veränderten Signalübertragung des B-Zell-Rezeptors (BCR) mit der Reaktion auf die dritte mRNA-Impfstoffdosis berichtet23. Obwohl in dieser speziellen Studie eine kürzliche Infektion vor der Impfung einen B-Zell-Phänotyp hervorrief, der zu einer gedämpften Impfreaktion führte, sollte in künftigen Arbeiten untersucht werden, ob molekulare Mechanismen, die die BCR-Signalisierung beeinträchtigen, bei zuvor infizierten Personen nach einer dritten mRNA-Impfstoffdosis häufiger auftreten als bei naive dreifach geimpfte Erwachsene.

Wir fanden heraus, dass die Spike-spezifischen Schleimhautantikörper nach der dritten mRNA-Impfstoffdosis niedrig waren und bei SARS-CoV-2-naiven und zuvor infizierten Personen ähnlich waren. Wir und andere haben gezeigt, dass mukosales IgA durch mRNA-Impfstoffe bei Personen mit einer Vorgeschichte von SARS-CoV-224,25 induziert wird. Daher war dieser Befund unerwartet und lässt sich möglicherweise durch unsere Auswahl einer Kohorte von Gesundheitspersonal erklären, bei denen ein Omicron aufgetreten ist Infektion, was möglicherweise eine Bereicherung für zuvor infizierte Personen darstellt, bei denen aufgrund der geringen Schleimhautimmunität ein erhöhtes Risiko einer Durchbruchinfektion besteht. Wir haben auch zuvor festgestellt, dass das Schleimhaut-IgA über 9 Monate nach der SARS-CoV-2-Infektion abnimmt26 und die Zeit bis zur ersten Infektion in unserer zuvor infizierten Kohorte viel länger war. Dennoch induzierte eine Omicron-Infektion mukosale SARS-CoV-2-spezifische sekretorische IgA- und Omicron-spezifische NAb-Reaktionen, unabhängig von der Vorgeschichte einer SARS-CoV-2-Infektion. Die Schleimhautimmunität ist wahrscheinlich sowohl für den Schutz vor Infektionen als auch für die übertragungsblockierende Immunität wichtig, wird jedoch durch derzeit zugelassene parenterale Impfstoffe nur unzureichend induziert. Unsere und andere Ergebnisse17,27 legen nahe, dass Omicron-Durchbruchsinfektionen bei geimpften Personen dazu beitragen können, diese Immunlücke zu schließen.

Wir zeigen, dass eine Omicron-Infektion die Spike-spezifischen T-Zell-Reaktionen bei zuvor naiven Personen und nicht-Spike-spezifische T-Zellen unabhängig von der Vorgeschichte von SARS-CoV-2 erhöhte, wobei Membran- und Nukleokapsid-spezifische T-Zellen in stärkerem Maße verstärkt wurden bei zuvor infiziertem medizinischem Personal. Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu denen von Blom et al.12, die mit dem Oxford Immunotech (OI) T-Spot-Assay keinen Anstieg der Spike-spezifischen Reaktionen nach einer Omicron-Infektion und ähnliche M- und N-spezifische T-Zell-Reaktionen fanden sowohl bei zuvor infizierten als auch bei nicht-naiven Individuen nach der Omicron-Therapie. Diese Unterschiede lassen sich möglicherweise durch die verwendeten Tests erklären, da wir zuvor in unserem ELISpot-Test über stärkere Reaktionen im Vergleich zum OI-Test berichtet haben, der nicht als quantitativer Test vermarktet wird28. Obwohl in unserer Studie die Spike-spezifischen T-Zellen nach einer Omicron-Infektion nicht zunahmen, zeigten zuvor infizierte Personen immer noch höhere S1-spezifische Reaktionen als ihre zuvor naiven Gegenstücke.

Die Charakterisierung immundominanter CD8+-Spike-Epitop-spezifischer Zellen bei zuvor infizierten Personen zeigte ebenfalls einen terminal differenzierten, hoch zytotoxischen Phänotyp. Der hohe Granzym-B-Gehalt in diesen T-Zellen ähnelte auffallend dem in CMV-spezifischen CD8+-T-Zellen, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie einen spät differenzierten Phänotyp mit hohem zytotoxischem Potenzial aufweisen, der sich von anderen antiviralen CD8+-T-Zellen unterscheidet29. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein Infektionsprimus, gefolgt von 3 mRNA-Impfstoffdosen, zu maximal induzierten Spike-spezifischen T-Zell-Reaktionen führt, mit begrenztem Potenzial für eine weitere Verstärkung, zumindest kurzfristig. Interessanterweise war der Granzym B-Gehalt von Spike-spezifischen CD8+ T-Zellen bei zuvor unbehandelten Personen nach der Omicron-Infektion viel niedriger als bei zuvor infizierten Personen vor der Omicron-Infektion. Da beide Szenarien eine Immunität nach vier Spitzenexpositionen darstellen, kann die Reihenfolge der Expositionen bei der Erzeugung einer Hybridimmunität im Hinblick auf das zytotoxische Potenzial von CD8+-T-Zellen von Bedeutung sein. Die T-Zell-Reaktionen auf Nicht-Spike-Ziele nahmen nach einer Omicron-Infektion bei allen Personen signifikant zu, wobei diejenigen mit früherem SARS-CoV-2 höhere Post-Omicron-Werte aufwiesen. Ein ähnlicher Vorteil bei Nukleokapsid-spezifischem IgG wurde bei zuvor infizierten Personen nach einer Omicron-Infektion beobachtet. Obwohl nicht zu erwarten ist, dass diese Antikörper zur NAb-Aktivität beitragen, könnte eine Schutzfunktion durch antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität oder andere nicht neutralisierende Effektorfunktionen bestehen30,31. Während 22,6 % der naiven Teilnehmer bei einer Omicron-Infektion keine nachweisbare N-spezifische IgG-Reaktion zeigten, steht dies im Einklang mit UKHSA-Daten, die zeigen, dass Durchbruchinfektionen bei vollständig geimpften Personen zu einer schlechten Induktion von N-spezifischem IgG führen, möglicherweise aufgrund der geringeren Erkrankungsrate erlebter Schweregrad32.

Die entscheidende Frage ist, ob Omicron-Infektionen bei geimpften Personen einen gewissen Schutz gegen nachfolgende Omicron-Viren bieten. Daten zur Wirksamkeit aus der Praxis stimmen mit unseren Erkenntnissen überein, dass Omicron-Infektionen bei geimpften Personen unterschiedliche Immunreaktionen auslösen oder verstärken. In Portugal, wo 98 % der Studienpopulation vor 2022 eine primäre 2-Dosen-Impfung abgeschlossen hatten und die mRNA-Auffrischungsimpfungsrate zu Beginn der BA.5-Welle 82 % betrug, betrug die Schutzwirkung von BA.1/BA .2 Durchbruchinfektionen gegen nachfolgende BA.5-Infektionen betrugen 75,3 % im Vergleich zu infektionsnaiven Geimpften, wohingegen die Wirksamkeit zuvor nach Durchbruchinfektionen mit anderen Varianten geringer war (z. B. 54,8 % nach Alpha, 61,3 % nach Delta)33. In einer dänischen Kohortenstudie wurde ebenfalls festgestellt, dass eine frühere Omicron-Infektion bei dreifach geimpften Personen zu 93,6 % vor einer nachfolgenden BA.5-Infektion schützt34.

Unsere Studie weist mehrere Einschränkungen auf, die berücksichtigt werden müssen und die Generalisierbarkeit unserer Ergebnisse beeinträchtigen können. Am wichtigsten ist, dass wir zuvor infizierte Personen ausgewählt haben, die innerhalb weniger Monate nach einer dritten mRNA-Impfstoffdosis einen Durchbruch bei Omicron-Infektionen hatten und die daher immunologisch möglicherweise nicht denen ähneln, die länger geschützt blieben. Der reale Schutz vor einer symptomatischen BA.1/BA.2-Infektion ist bei Personen mit einer Infektion, gefolgt von drei mRNA-Impfstoffdosen, größer als bei SARS-CoV-2-naiven, dreifach geimpften Personen35, daher haben wir wahrscheinlich eine Anreicherung für zuvor infizierte Personen mit niedrigeren Dosen vorgenommen schützende Immunität. In den meisten Experimenten haben wir auch bewusst Reaktionen auf ganze Proteine ​​und nicht auf spezifische Epitope berücksichtigt, um die Breite der durch eine SARS-CoV-2-Infektion erzeugten Immunität zu erfassen. Es ist wahrscheinlich, dass individuelle epitopspezifische Unterschiede zwischen Gruppen bestehen, einschließlich derjenigen, die von Mutationen in Viren der Omicron-Linie betroffen sind. Darüber hinaus ist unsere Kohorte von Gesundheitspersonal relativ jung und gesund und daher nicht vollständig repräsentativ für die Gesamtbevölkerung.

Obwohl die Impfung nach wie vor der sicherste Weg ist, eine Immunität gegen SARS-CoV-2 zu erlangen, deuten zunehmende Daten darauf hin, dass eine infektionsinduzierte Immunität bei SARS-CoV-2-Geimpften einen verbesserten Schutz bieten kann. Beispielsweise wird geschätzt, dass der Schutz vor einer BA.4/5-Infektion bei Erwachsenen im Vereinigten Königreich mit einer Delta/Omicron-Durchbruchsinfektion nach zwei Impfdosen dauerhafter ist als bei dreifach geimpften Erwachsenen ohne Infektionsgeschichte36. Bisher gibt es epidemiologische Belege dafür, dass die hybride Immunität einen guten Schutz gegen BA.4/5 bietet. Beispielsweise lag der Schutz vor Krankenhausaufenthalten mit BA.4/5 in einer Studie an Erwachsenen in Quebec für mindestens 6–8 Monate bei über 90 % über 60 Jahre alt, die zu irgendeinem Zeitpunkt mindestens zwei Impfdosen und eine Infektion erhalten hatten37. Da in hochgeimpften Bevölkerungsgruppen immer mehr SARS-CoV-2-Infektionen auftreten, wird die Natur der hybriden Immunität bei Einzelpersonen komplexer und heterogener. Wir haben gezeigt, dass Immunkomponenten, die durch derzeit verfügbare Impfstoffe nicht induziert werden, wie z. B. Schleimhaut- und Nicht-Spike-Reaktionen, durch eine Virusinfektion verstärkt werden. Diese spielen möglicherweise eine entscheidende Rolle beim Aufbau einer schützenden Immunität gegen SARS-CoV-238, sollten aber auch als Ziele priorisiert werden, um die durch die nächste Generation von Impfstoffen hervorgerufenen Reaktionen zu erweitern.

Die PITCH-Studie (Protective Immunity from T Cells to Covid-19 in Health Workers) ist eine prospektive Beobachtungskohortenstudie mit 2149 Beschäftigten im Gesundheitswesen (HCWs), die an fünf Standorten im Vereinigten Königreich (University Hospitals Birmingham NHS Foundation Trust, Liverpool University Hospitals NHS Foundation) rekrutiert wurden Trust, Newcastle upon Tyne Hospitals NHS Foundation Trust, Oxford University Hospitals NHS Foundation Trust und Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust). Teilnahmeberechtigt waren Erwachsene ab 18 Jahren, die derzeit im Gesundheitswesen tätig sind, einschließlich alliierter Hilfs- und Labormitarbeiter. Die Rekrutierung der Personen erfolgte durch Mundpropaganda, E-Mail-Kommunikation des Krankenhauses, durch SARS-CoV-2-Screeningprogramme des Krankenhauspersonals sowie durch die Einschreibung im Rahmen der umfassenderen SIREN-Studie, zu der PITCH eine Teilstudie ist. Die SIREN-Studie ist bei ISRCTN registriert (Studien-ID:252 ISRCTN11041050) und wurde vom Berkshire Research Ethics Committee, Health Research 250 Authority (IRAS ID 284460, REC-Referenz 20/SC/0230) genehmigt, wobei PITCH als Sub-Studie anerkannt wurde. Studie am 2. Dezember 2020. Einige Teilnehmer wurden im Rahmen anderer protokollorientierter, von der REC genehmigter Studien rekrutiert; In Liverpool wurden einige Teilnehmer im Rahmen der Studie „Humane Immunantworten auf akute Virusinfektionen“ (16/NW/0170) rekrutiert, die am 8. März 2016 vom North West-Liverpool Central Research Ethics Committee genehmigt und am 14. und 4. September 2020 geändert wurde Mai 2021. In Oxford wurden Teilnehmer im Rahmen der GI-Biobank-Studie 16/YH/0247 rekrutiert, die am 29. Juli 2016 vom Research Ethics Committee (REC) des Yorkshire & The Humber – Sheffield Research Ethics Committee genehmigt und entsprechend geändert wurde Zweck am 8. Juni 2020. In Sheffield wurden Teilnehmer im Rahmen der Observational Biobanking-Studie STHObs (18/YH/0441) rekrutiert, die am 10. September 2020 für diese Studie geändert wurde. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Erklärung von durchgeführt Helsinki (2008) und die Leitlinien der International Conference on Harmonisation Good Clinical Practice. Alle eingeschriebenen Teilnehmer gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab.

Die Teilnehmer wurden zum Zeitpunkt der Aufnahme in die PITCH-Studie entweder als SARS-CoV-2-naiv oder zuvor infiziert definiert, basierend auf dokumentierter PCR und/oder Serologie von lokalen NHS-Trusts oder auf der Grundlage einer MSD-Analyse der S- und N-Plasma-IgG-Spiegel von PITCH Proben8. Den Patienten wurden 28 Tage nach der dritten Impfdosis und 28 Tage nach der dokumentierten SARS-CoV-2-Infektion Proben entnommen. Bei jedem Besuch wurden Streifen mit synthetischer Absorptionsmatrix (SAM) gesammelt, um Nasenschleimhautflüssigkeit zu gewinnen, und heparinisiertes Vollblut wurde gesammelt, das mittels Dichtegradientenzentrifugation in Plasma und mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PMBCs) aufgetrennt wurde. Eine Probe der Nasenschleimhautflüssigkeit wurde entnommen, indem der SAM-Streifen in das Nasenloch eingeführt und durch leichten Fingerdruck auf der Außenseite der Nase eine Minute lang gegen die Schleimhaut gehalten wurde.

Die Neutralisierungsfähigkeit von Plasma wurde mithilfe eines Focus Reduction Neutralization Test (FRNT) gemessen. Kurz gesagt, seriell verdünntes Plasma wurde mit lebendem SARS-CoV-2-Virus eines Vorfahrenstamms (Australien/VIC01/2020), BA.1, BA.2 oder BA.5, gemischt und dann 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Das Plasma-Virus-Gemisch wurde dann auf zellkulturbehandelte 96-Well-Mikrotiterplatten mit flachem Boden und konfluenten Monoschichten von Vero-Zellen (ATCC, CCL-81) in zweifacher Ausfertigung übertragen und weitere 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde in jede Vertiefung 1,5 % Carboxymethylcellulose (CMC)-Overlay-Medium, verdünnt in Dulbecco's Modified Eagle Medium (Gibco, 31966047) mit 1 % FBS (DMEM1), gegeben. Ein Fokusbildungstest wurde durchgeführt, nachdem die Zellen 24 Stunden lang bei 37 °C mit dem Virus inkubiert worden waren. Vero-Zellen wurden mit 4 % Formaldehyd (Sigma, F8775) fixiert, mit 2 % Triton-X (Sigma, T9284) permeabilisiert, dann mit humanem Anti-N-mAb (mAb206, selbst hergestellt39) bei 2 µg/ml gefärbt, gefolgt von Peroxidase-konjugiertes Ziegen-Anti-Human-IgG (Sigma, A0170). Nach der Färbung wurden die Herde durch Zugabe von TrueBlue Peroxidase Substrate (SeraCare, 5510-0030) sichtbar gemacht und in den Vertiefungen ohne Plasma wurden etwa 100 Herde beobachtet. Die Infektionszahlen wurden auf dem AID EliSpot-Lesegerät mithilfe der AID ELISpot-Software gezählt. Der Prozentsatz der Fokusreduktion wurde für jedes Plasma berechnet und FRNT50, die reziproke Verdünnung des Plasmas, die erforderlich ist, um 50 % des Eingangsvirus zu neutralisieren, wurde mit dem Probit-Programm aus dem SPSS-Paket bestimmt.

Die SARS-CoV-2-spezifischen IgG- und IgA-bindenden Antikörperspiegel im Plasma wurden mithilfe der Multiplex-Mesoscale-Discovery-Plattform (MSD) V-PLEX SARS-CoV-2 Panel 27 IgG (Meso Scale Diagnostics, K15606U) und V-PLEX SARS- CoV-2 Panel 27 IgA-Kits (Meso Scale Diagnostics, K15608U). Die Tests wurden gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll durchgeführt. Platten, die mit SARS-CoV-2-Spike-Antigen-Spots (einschließlich Wuhan-Hu-1 und den Omicron-Sublinien BA.2 und BA.5) vorbeschichtet waren, wurden mit 150 µL Blocker-A-Lösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) blockiert. , Schütteln bei 800 U/min. Auf Kit-27-Platten war kein BA.1-Sublinienprotein vorhanden. Die Platten wurden gewaschen und 50 µl/Well-Plasmaproben, verdünnt auf 1:40.000 in Diluent 100, wurden in zweifacher Ausfertigung geladen und 2 Stunden lang bei RT unter Schütteln bei 800 U/min inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und 50 µl/Vertiefung einer 1x Detektionsantikörperlösung in jede Vertiefung gegeben und 1 Stunde lang unter Schütteln bei 800 U/min inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und 150 µL MSD GOLD Read Buffer B in die Vertiefungen gegeben, bevor sie sofort mit einem MESO® SECTOR S 600-Gerät (Discovery Bench-Softwareversion 4.0) abgelesen wurden.

Nukleokapsid-IgG wurde mit einem hauseigenen ELISA40 bewertet. Hochbindende 96-Well-ELISA-Platten (Immulon 4HBX; Thermo Scientific, 6405) wurden über Nacht bei 4 °C mit 50 µL/Well in Escherichia coli (Uniprot ID P0DTC9 (NCAP_SARS2)) hergestelltem, unmarkiertem Nukleokapsidprotein in voller Länge beschichtet, verdünnt auf 2 µg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,4. Die Platten wurden mit 0,05 % PBS-Tween gewaschen und dann 1 Stunde lang mit 200 µL/Well 0,5 % Caseinpuffer blockiert. Plasmaproben wurden auf 1:200 verdünnt und 100 µL in doppelte Vertiefungen gegeben. Die Platten wurden 1 Stunde lang bei RT inkubiert, dann gewaschen und mit 100 µL/Well Ziegen-Anti-Human-IgG-HRP-Konjugat (Invitrogen, 62-8420) im Verhältnis 1:500 beladen. Die Platten wurden 2 Stunden lang bei RT inkubiert, dann gewaschen und 10 Minuten lang mit 100 µL/Well TMB-Substrat (KPL, 5120-0074) entwickelt und mit 100 µL/Well HCl-Stopplösung (KPL, 5150-0021) gestoppt. Die Absorption bei 450 nm (A450) wurde sofort mit einem HIDEX-Sense-Luminometer (HIDEX-Sense-Plattenleser-Softwareversion 1.2.1.) abgelesen.

Um die Quantifizierung der Antikörperkonzentration zu ermöglichen, haben wir eine 12-stufige Standardkurve einbezogen, die aus gepoolten Seren von rekonvaleszenten SARS-CoV-2-bestätigten Patienten besteht und auf den internationalen Standard der WHO für Anti-SARS-CoV-2-Immunglobulin (NIBSC, 20/ 136), wobei die Ergebnisse in Bindungsantikörpereinheiten/ml (BAU/ml) angegeben werden. Wie bereits berichtet40, wurde der Serostatus der Proben auf der Grundlage eines Schwellenwerts bestimmt, der zur Maximierung der Empfindlichkeit ausgewählt und anhand von Seren von PCR-bestätigten SARS-CoV-2-Rekonvaleszenzpatienten und Proben aus der Zeit vor 2019 validiert wurde. Proben, die gemäß diesem Schwellenwert als negativ galten, erhielten einen Wert von 1,04 BAU/ml, die Hälfte des Wertes des niedrigsten Punktes auf der Standardkurve.

Der Gehalt an Spike- und Nukleokapsid-spezifischem dimerem sekretorischem IgA (sIgA), das in der Nasenschleimhautflüssigkeit vorhanden ist, wurde in einem ELISA unter Verwendung eines primären Antikörpers ermittelt, der auf die menschliche sekretorische Komponente abzielt. Um eine Normalisierung der SARS-CoV-2-spezifischen sIgA-Ergebnisse zu ermöglichen, wurden auch die Gesamt-sIgA-Werte bestimmt.

Zum Nachweis von SARS-CoV-2-Antikörpern wurden hochbindende 96-Well-ELISA-Platten (Immulon 4HBX; Thermo Scientific, 6405) über Nacht bei 4 °C mit 50 µL/Well SARS-CoV-2-Spike-Proteinen beschichtet, die die SARS-CoV-2-Antikörper darstellen. CoV-2 D614G (Sino Biological 40589-V08H8), Omicron BA.1 (40589-V08H26), BA.2 (40589-V08H28) oder BA.4 (40589-V08H32) Viren, verdünnt auf 1 µg/ml bei einem pH-Wert von 7,4 PBS oder unmarkiertes Nukleokapsidprotein voller Länge, hergestellt in Escherichia coli (Uniprot ID P0DTC9 (NCAP_SARS2)), verdünnt auf 2 µg/ml in PBS mit einem pH-Wert von 7,4. Für Gesamt-sIgA-ELISAs wurden die Platten über Nacht mit Ziegen-Anti-Human-Kappa- und Lambda-Leichtketten-Antikörpern (Southern Biotech, 2060-01, 2070-01) beschichtet, die jeweils auf 2 µg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco verdünnt waren. Die Platten wurden mit 0,05 % PBS-Tween gewaschen und 1 Stunde lang mit 200 µL/Well 1 % Caseinpuffer blockiert.

Zum Nachweis von SARS-CoV-2-spezifischem sIgA wurden die Proben doppelt in einer 5-Well-Verdünnungsreihe getestet, wobei in 2 Schritten von 1:10 bis 1:160 vorgegangen wurde. Die Platten wurden mit 50 µL Probe pro Vertiefung beladen und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Für jede Probe wurde eine Kurve erstellt, indem A450 gegen einen Verdünnungskoeffizienten aufgetragen wurde. Dies wurde verwendet, um für jede Probe den Wert der Fläche unter der Kurve (AUC) zu berechnen. Um Gesamt-sIgA nachzuweisen, wurde die Nasenschleimhautflüssigkeit in zwei Vertiefungen im Verhältnis 1:4000 getestet. Zu Quantifizierungszwecken wurde eine Standardkurve von menschlichem IgA aus Kolostrum (Sigma, I2636) in eine 12-Well-Verdünnungsreihe einbezogen, die in 2-Schritten ausgehend von einer anfänglichen Verdünnung von 1 µg/ml erfolgte. Die Platten wurden 1 Stunde lang bei 36 °C inkubiert. Nach der Probeninkubation wurden die Platten (sowohl spezifisch als auch insgesamt) gewaschen und mit 100 µL/Well Maus-Anti-Human-Sekretionskomponenten-Antikörper (HP6141, Calbiochem, 411423) bei 1 µg/ml für 2 Stunden bei RT beladen. Die Platten wurden gewaschen und mit Ziege-Anti-Maus-IgG-HRP-Konjugat (Invitrogen, 31439) im Verhältnis 1:500 für 1 Stunde bei RT beladen, dann gewaschen und 5 Minuten lang mit 50 µL/Well TMB-Substrat (KPL, 5120-0074) entwickelt. vor Zugabe von 50 µL/Well HCl-Stopplösung (KPL, 5150-0021). A450 wurde sofort mit einem HIDEX-Sense-Luminometer gemessen. SARS-CoV-2-spezifische sIgA-AUC-Werte wurden auf das Gesamt-sIgA aus derselben Probe normalisiert.

Die SARS-CoV-2-spezifische Ersatzneutralisierungsfähigkeit der Nasenschleimhautflüssigkeit wurde mit dem MSD V-PLEX SARS-CoV-2 Panel 27 ACE2 Kit (Meso Scale Diagnostics, K15609U) bewertet, das die Fähigkeit von Proben bewertet, die Bindung von ACE2 zu verhindern gegen SARS-CoV-2-Spike-Antigene, einschließlich Wuhan-Hu-1, und die Omicron-Sublinien BA.2 und BA.5. SAM-Streifen wurden in einen Puffer aus PBS, 1 % BSA und Proteaseinhibitor-Cocktail I (Calbiochem, 539131) eluiert. Mit SARS-CoV-2-Antigen-Spots vorbeschichtete Platten wurden mit 150 µL Blocker-A-Lösung 30 Minuten lang bei RT unter Schütteln bei 800 U/min blockiert. Die Platten wurden gewaschen und eluierte Nasenschleimhautflüssigkeitsproben wurden unverdünnt mit 25 µL/Vertiefung im Duplikat geladen und 1 Stunde lang bei RT unter Schütteln bei 800 U/min inkubiert. Nach der Inkubation wurden 25 µL 1× SULFO-TAG Human ACE2 Protein-Lösung ohne Waschen oder Absaugen der Probe in die Vertiefungen gegeben und 1 Stunde lang bei RT unter Schütteln bei 800 U/min inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und 150 µL/Well MSD GOLD Read Buffer B hinzugefügt, bevor die Messung sofort mit einem MESO® SECTOR S 600-Gerät durchgeführt wurde. Die neutralisierende Aktivität der Proben wurde als Prozentsatz der ACE2-Hemmung im Vergleich zu einem Zustand ohne Nasenschleimhautflüssigkeit auf derselben Platte ausgedrückt.

IFN-γ-ELISpot-Assays wurden an kryokonservierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) unter Verwendung des ELISpot Flex Human IFN-γ-Kits (Mabtech, 3420-2 A) durchgeführt. Die Tests wurden in Sheffield, Oxford und Newcastle unter Verwendung des gleichen zuvor harmonisierten und veröffentlichten Protokolls8 durchgeführt. Überlappende Peptidpools (18-mer-Peptide mit 10-Aminosäure-Überlappung, Mimotope), die die S1- und S2-Untereinheiten der SARS-CoV-2 Wuhan-hu-1-, Omicron BA.1- und Omicron BA.2-Spike-Proteine ​​darstellen, gepoolte angestammte Wuhan- hu-1-Membran- und Nukleokapsidproteine ​​sowie nichtstrukturelle Proteine ​​(NSP1+2, NSP3b+c, NSP4-6, NSP7-11, NSP12 und NSP13+14) wurden verwendet, um PBMCs bei 2 µg/ml zu stimulieren. Als Positivkontrollen wurden auch Pools von CMV-, EBV- und Influenza-Peptiden (CEF) mit 2 µg/ml und Phytohämagglutinin (PHA) mit 1 µg/ml sowie ein reiner Zellzustand einbezogen. Sterile 96-Well-Platten mit 0,45 µm PVDF-Membran wurden mit 50 µL/Well Anti-IFN-γ-Beschichtungsantikörper, verdünnt auf 10 µg/ml in sterilem PBS, beschichtet und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Platten wurden mit sterilem PBS gewaschen und mit 200 µL/Well R10 (RPMI + 10 % FBS + 1 % Pen/Strep) blockiert. Nach mindestens 2-stündiger Inkubation bei 37 °C wurden die Vertiefungen geleert und 200.000 in 50 µL R10 verdünnte Zellen in jede Vertiefung gegeben. 50 µL Peptidpools wurden in die Vertiefungen gegeben und die Platten wurden 18–24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, gewaschen und vor der Inkubation mit 100 µL/Vertiefung biotinylierter sekundärer Antikörper, verdünnt auf 1 µg/ml in PBS 0,5 % BSA, beladen 2–4 Stunden bei RT. Die Platten wurden gewaschen und 100 µl/Vertiefung Streptavidin-ALP-Konjugat, verdünnt in PBS auf 1 mg/ml, in die Vertiefungen gegeben und 40 Minuten bei RT inkubiert. Die Platten wurden mit dem AP-Konjugat-Substrat-Kit (Biorad, 170-6432) entwickelt. Die Platten wurden gewaschen und 100 µl Nachweislösung in die Vertiefungen gegeben und 15 Minuten bei RT inkubiert. Die Platten wurden mit Leitungswasser gewaschen und trocknen gelassen, bevor sie auf dem AID EliSpot-Lesegerät abgelesen wurden. Die Spots wurden mit der AID ELISpot-Software Version 8.0 gezählt, doppelte Wells wurden gemittelt und der Nur-Zell-Wert abgezogen, und virusspezifische Reaktionen wurden als Spot-Forming Units (SFUs)/106 Zellen ausgedrückt. Ein Grenzwert für die Positivität wurde bestimmt, indem der Mittelwert + 2 Standardabweichung des SFU/106-Zellwerts aller Nur-Zellen-Kontrollvertiefungen herangezogen wurde. Negativen Ergebnissen wurde ein Wert von 1 SFU/106 zugewiesen.

DNA wurde aus kryokonservierten Vollblutproben mit dem DNeasy® Blood and Tissue Kit (QIAGEN, 69504) gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert. Die in Newcastle ansässige Teilnehmer-HLA-Typisierung für Klasse I (HLA-A; B; C) wurde von MC Diagnostics Limited (Wales, Vereinigtes Königreich) durchgeführt. Die HLA-Klasse-I-Typisierung der Sheffield-Teilnehmer wurde an der Universität Oxford durchgeführt, indem die Exons 2 und 3 für jeden Locus mit hausinternen sequenzspezifischen Primern amplifiziert und auf einem AB3730-Gerät von Applied Biosystems sequenziert wurden. Die Analyse erfolgte durch den Vergleich heterozygoter Spuren mit bekannten Sequenzen in der IMGT-HLA-Datenbank mit 4-stelliger Auflösung41.

Kryokonservierte PBMCs wurden schnell aufgetaut und 2–4 Stunden lang in R10-Medium (RPMI + 10 % FBS + 1 % Pen/Strep) bei 37 °C ruhen gelassen. Nach dem Ruhen und vor dem Färben wurden die Zellen in PBS gewaschen und in FACS-Röhrchen mit 2–3 × 106 Zellen pro Probe aufgeteilt. Zunächst wurden Proben und HLA-nicht übereinstimmende Negativkontrollspender mit PE-konjugiertem SARS-CoV-2-Spike oder nicht-Spike-spezifischen MHC-Pentameren/Dextrameren (PE-HLA-A*03:01 KCYGVSPTK S378, ProImmune, Peptidcode 4443, PE-HLA-A*02:01 YLQPRTFLL S269, PE-HLA-A*01:01 LTDEMIAQY S865, PE-HLA-B*57:01 GTITSGWTF S879, PE-HLA-A*01:01 TTDPSSFLGRY RP1637, PE- HLA-B*07:02 SPRWYFYYL NCP105, Tabelle S3.) und APC-konjugiertes EBV und CMV-Pentamer/Dextramere (APC-HLA-A*02:01 GLCTLVAML BMLF-1259, APC-HLA-B*07:02-RPPIFIRRL EBNA -3A247, APC-HLA-A*03:01 RLRAEQVK EBNA-3A603 oder APC-HLA-A*02:01 NLVPMVATV CMV pp65495, Tabelle S3.) für 15 Minuten bei 37 °C. Ersatz-CD3-Konjugate für PE und APC wurden als Referenzkontrollen zum Entmischen entweder durch Anfärben von Zellen (Newcastle) oder Perlen (Sheffield) verwendet. Nach der Pentamer/Dextramer-Färbung wurden die Proben in PBS gewaschen und im Restvolumen (~50 μl) resuspendiert. Die Proben wurden 10 Minuten lang bei RT mit Live/Dead Zombie NIR (Biolegend, 423106) gefärbt. Anschließend wurde ohne Waschen der in Brilliant Stain Buffer (Becton Dickinson, 563794) verdünnte Oberflächen-Antikörpercocktail weitere 20 Minuten lang zugegeben. Einzelfärbungs-Referenzkontrollen wurden gemäß den Tabellen S1 und S2 mit 2–5 × 105 Zellen/ml oder UltraComp eBeads™ (ThermoFisher, 01-2222-42) gefärbt. Die Live/Dead Zombie NIR-Referenzkontrolle wurde durch Anfärben einer 50/50-Mischung aus lebenden und hitzeinaktivierten (56 °C, 7 Min.) PBMCs hergestellt. Im Anschluss an die extrazelluläre Färbung wurden in Sheffield vorbereitete Proben auch mit dem BD Cytofix/Cytoperm™ Kit (Kat.-Nr. 554714) gemäß den Anweisungen des Herstellers auf Granzym B gefärbt. Proben und Referenzkontrollen in Newcastle wurden nach extrazellulärer Färbung in PBS gewaschen und 20 Minuten in 2 % Formaldehyd bei RT fixiert. Nach der Fixierung wurden die Proben in FACS-Puffer gewaschen und in einem geeigneten Volumen zur Aufnahme auf einem CyTEK AURORA 3 L (Sheffield) oder 5 L (Newcastle) System resuspendiert. Die Daten wurden unter Verwendung einer Kombination aus Perlen- und Zellreferenzkontrollen entmischt, wie in den Tabellen S1 und S2 beschrieben, und bei Bedarf wurde eine Kompensation nach dem Entmischen angewendet.

Die statistische Analyse wurde mit GraphPad Prism 9.4.1 für Windows durchgeführt. Vergleiche zwischen kontinuierlichen Daten von SARS-CoV-2-naiven und zuvor infizierten Gruppen wurden mithilfe von Mann-Whitney-Tests oder Kruskal-Wallis-Tests mit Dunns Post-hoc-Test für Mehrfachvergleiche und kategorialen Daten im Vergleich mit dem exakten Fisher-Test durchgeführt. Paarweise Vergleiche innerhalb von Gruppen wurden mithilfe von Wilcoxon-Matched-Pair-Signed-Rank-Tests durchgeführt. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde mit der SIMON-Softwareversion 0.2.1 (https://genular.org)42 durchgeführt. Vor der Durchführung der PCA wurden die Daten vorverarbeitet (Mitte/Skala), fehlende Werte wurden dem Medianwert unterstellt und Variablen mit weniger als 5 eindeutigen Werten wurden entfernt. Als Gruppierungsvariablen wurden Geschlecht, Ort, früherer Infektionsstatus und Zeitpunkte verwendet und daher nicht in die Analyse einbezogen. Die Qualität von Individuen und Variablendarstellungen (cos2), Variablenkorrelationen und Beiträge (Prozentsatz) der Top-10-Variablen aus den ersten beiden Hauptkomponenten (PC1 und PC2) wurden berechnet. Der cos2-Wert (Quadratkosinus, quadrierte Koordinaten) wird verwendet, um zu messen, wie gut eine Variable in einem Diagramm dargestellt wird. Ein hoher cos2 bedeutet, dass die Variable gut dargestellt ist und nahe dem Rand eines Kreises positioniert ist. Ein niedriger cos2 bedeutet, dass die Variable nicht gut dargestellt ist und näher am Mittelpunkt des Kreises positioniert ist. Die Summe der cos2-Werte für eine Variable aller Hauptkomponenten beträgt eins43,44.

Die Gating-Analyse der Durchflusszytometriedaten wurde in SpectroFlo® (Version 3.0.0) durchgeführt. Die Daten wurden für lebende CD3+CD8+-Pentamer/Dextramer+-Populationen aus zwölf Chargen an zwei verschiedenen Standorten (Sheffield, Newcastle) erfasst (Abb. S7). HLA-nicht übereinstimmende Pentamer/Dextramer-Färbungen wurden verwendet, um das Gating für positive Ereignisse zu bestimmen (Abb. S8), und diese Pentamer/Dextramer+-Populationen wurden basierend auf ihren Expressionsmustern der Marker CD45RO, CCR7, CD28 und CD95 in Gedächtnis-T-Zell-Untergruppen sortiert (Abb. S9). Eine Pentamer/Dextramer-Ereignisrate von ≥20 (zweidimensionales Gating, kombinierte Daten von beiden Standorten) oder ≥0,01 % der gesamten CD8+-Population (mehrdimensionales Clustering, Daten von separat analysierten Standorten) wurde als Schwellenwert für die Weiterentwicklung verwendet Populationen zur weiteren Analyse.

Die mehrdimensionale Analyse von Durchflusszytometriedaten wurde in R mit den Paketen readxl, CATALYST, cowplot, flowCore, scater, SingleCellExperiment, openxlsx und ggpubr durchgeführt. FCS-Daten von Multimer-positiven Gates wurden unter Verwendung eines Cofaktors von 150 und FlowSOM-Clustering, das auf alle auf Pentamer/Dextramer-spezifischen Zellen vorhandenen Kanalmarker angewendet wurde, einem maxK von 10 und einem zufälligen Seed transformiert. Die Dimensionsreduktion wurde mit UMAP durchgeführt. Der statistische Vergleich der Markerexpressionsniveaus wurde mithilfe von Kruskal-Wallis durchgeführt, mit t-Tests für Einzelvergleiche und angepassten p-Werten.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Der vollständige in dieser Studie verwendete Datensatz wurde im Open Science Framework verfügbar gemacht, https://doi.org/10.17605/OSF.IO/9TSZ645. Die in der UMAP- und Markerexpressionsanalyse verwendeten FCS-Daten wurden in den Zenodo-Datenbanken https://doi.org/10.5281/zenodo.8045040 und https://doi.org/10.5281/zenodo.804510746,47 hinterlegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der Code, der zur Durchführung der UMAP- und Markerexpressionsanalyse in den Abb. S4–6 wurde in den Zenodo-Datenbanken https://doi.org/10.5281/zenodo.8045040 und https://doi.org/10.5281/zenodo.804510746,47 hinterlegt.

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Diese Arbeit wurde teilweise vom britischen Ministerium für Gesundheit und Soziales im Rahmen des PITCH-Konsortiums (Protective Immunity from T Cells to Covid-19 in Health Workers) und vom UKRI im Rahmen der „Untersuchung des nachgewiesenen Durchbruchs bei Impfstoffen durch SARS“ finanziert -CoV-2-Varianten in etablierten Kohorten von Gesundheitspersonal im Vereinigten Königreich: SIREN-Konsortium & PITCH Plus Pathway“ MR/W02067X/1 und UKRI als Teil von „PITCH2 – Protective Immunity through T Cells in Healthcare Workers 2“ MR/X009297/1, mit Beiträgen vom UKRI/NIHR über das UK Coronavirus Immunology Consortium (UK-CIC), die Huo Family Foundation und das National Institute for Health Research (UKRIDHSC COVID-19 Rapid Response Rolling Call, Grant Reference Number COV19-RECPLAS). EB und PK sind NIHR Senior Investigators und PK wird vom NIH finanziert (U19 I082360) und diese Arbeit wird teilweise vom Wellcome Trust (WT222426/Z/21/Z) finanziert. SJD wird durch eine NIHR Global Research Professorship (NIHR300791) finanziert. RPP wird durch ein Career Re-entry Fellowship (204721/Z/16/Z) finanziert. CJAD wurde durch Stipendien von Wellcome (211153/Z/18/Z) und dem Medical Research Council (MR/X001598/1) unterstützt. Diese Studie wurde von der NIHR Newcastle Clinical Research Facility unterstützt. TD, JM und GS werden vom Innovation Fund for Medical Science (CIFMS) der Chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften (CAMS), China (Fördernummer: 2018-I2M-2-002), Schmidt Futures, der Red Avenue Foundation und finanziert die Oak Foundation. Das Wellcome Center for Human Genetics wird vom Wellcome Trust unterstützt (Zuschuss 090532/Z/09/Z). LT wird vom Wellcome Trust (Fördernummer 205228/Z/16/Z) und der National Institute for Health Research Health Protection Research Unit (NIHR HPRU) in Emerging and Zoonotic Infections (NIHR200907) an der University of Liverpool in Zusammenarbeit mit UKHSA unterstützt , in Zusammenarbeit mit der Liverpool School of Tropical Medicine und der University of Oxford. DGW wird durch ein NIHR Advanced Fellowship in Liverpool unterstützt. MC, SL, LT und TT werden durch den Vertrag 75F40120C00085 der US Food and Drug Administration Medical Countermeasures Initiative unterstützt. Die Beobachtungsstudie des Sheffield Teaching Hospitals an Patienten mit pulmonaler Hypertonie, Herz-Kreislauf- und anderen Atemwegserkrankungen (STH-ObS) wurde von der British Heart Foundation (PG/11/116/29288) unterstützt. Der STH-ObS-Chefforscher Allan Laurie wird von einem Senior Basic Science Research Fellowship der British Heart Foundation (FS/18/52/33808) unterstützt. Wir danken dem britischen Ministerium für Gesundheit und Soziales für die finanzielle Unterstützung durch den Sheffield NIHR Clinical Research Facility Award an den Sheffield Teaching Hospitals Foundation NHS Trust. Der Wellcome Trust-Zuschuss wird als UNS104697 Spectral Cytometry für die Profilierung einzelner Zellen des Immunsystems in Gesundheit und Krankheit nach A Filby/NUFCCF anerkannt. Die geäußerten Ansichten sind die der Autoren und nicht unbedingt die des NHS, des NIHR, des Gesundheitsministeriums oder von Public Health England. Für die Zwecke des Open Access hat der Autor eine öffentliche CC BY-Urheberrechtslizenz auf alle vom Autor akzeptierten Manuskriptversionen angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergeben.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Hailey Hornsby, Alexander R. Nicols, Stephanie Longet, Chang Liu.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Alex Richter, Lance Turtle, Sarah L. Rowland-Jones, Miles Carroll, Christopher JA Duncan, Paul Klenerman, Susanna J. Dunachie, Rebecca P. Payne, Thosehan I. de Silva.

Eine vollständige Liste der Mitglieder und ihrer Zugehörigkeiten finden Sie in den Zusatzinformationen.

Abteilung für klinische Medizin, School of Medicine and Population Health, The University of Sheffield, Sheffield, Großbritannien

Hailey Hornsby, Adrienn Angyal, Peijun Zhang, Martha Gallis, Natalie A. Barratt, Lotta Gustafsson, Scarlett Strickland, Irina Grouneva, Sarah L. Rowland-Jones und Thosehan I. de Silva

Institut für translationale und klinische Forschung, Thema Immunität und Entzündung, Newcastle University, Newcastle, Großbritannien

Alexander R. Nicols, Jessica K. Tyerman, Jeremy M. Nell, Christopher JA Duncan und Rebecca P. Payne

Pandemic Sciences Institute, Nuffield Department of Medicine, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Stephanie Longet, Tom Tipton und Miles Carroll

Wellcome Centre for Human Genetics, Nuffield Department of Medicine, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Stephanie Longet, Chang Liu, Tom Tipton, Piyada Supasa, Muneeswaran Selvaraj, Juthathip Mongkolsapaya, Gavin Screaton und Miles Carroll

National Emerging Infectious Diseases Laboratories, Boston University, Boston, MA, USA

Adriana Tomic

Abteilung für Mikrobiologie, Boston University School of Medicine, Boston, MA, USA

Adriana Tomic

Abteilung für Biomedizintechnik, Boston University, Boston, MA, USA

Adriana Tomic

Oxford Vaccine Group, Abteilung für Pädiatrie, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Adriana Tomic, Sagida Bibi und Teresa Lambe

Peter Medawar-Gebäude für Pathogenforschung, Nuffield Department of Clinical Medicine, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Barbara Kronsteiner, Priyanka Abraham, Isabel Neale, Mohammad Ali, Paul Klenerman und Susanna J. Dunachie

NDM-Zentrum für globale Gesundheitsforschung, Nuffield, Abteilung für klinische Medizin, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Barbara Kronsteiner, Priyanka Abraham, Isabel Neale, Mohammad Ali und Susanna J. Dunachie

Abteilung für Infektions- und Tropenmedizin, Newcastle upon Tyne Hospitals NHS Foundation Trust, Newcastle upon Tyne, Großbritannien

Jeremy M. Nell & Christopher JA Duncan

Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust, Sheffield, Großbritannien

Lotta Gustafsson, Scarlett Strickland, Sarah L. Rowland-Jones und Because I. de Silva

MRC Human Immunology Unit, MRC Weatherall Institute of Molecular Medicine, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Timothy Rostron & Tao Dong

NIHR Health Protection Research Unit in Emerging and Zoonotic Infections, Institute of Infection, Veterinary and Ecological Sciences, University of Liverpool, Liverpool, Großbritannien

Shona C. Moore, Luisa M. Hering, Susan L. Dobson, Dan Wootton und Lance Turtle

Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften (CAMS) Oxford Institute (COI), Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Juthathip Mongkolsapaya, Teresa Lambe, Tao Dong und Gavin Screaton

Liverpool University Hospitals NHS Foundation Trust, Liverpool, Großbritannien

Dan Wootton

Institut für Infektions-, Veterinär- und Ökologiewissenschaften, Universität Liverpool, Liverpool, Großbritannien

Dan Wootton

UK Health Security Agency, London, Großbritannien

Victoria Hall & Susan Hopkins

Medizinische Fakultät, Abteilung für Infektionskrankheiten, Imperial College London, London, Großbritannien

Victoria Hall & Susan Hopkins

NIHR Health Protection Research Unit in Healthcare Associated Infection and Antimicrobial Resistance, University of Oxford, Oxford, Großbritannien

Susan Hopkins

Nuffield Department of Medicine, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Tao Dong & Eleanor Barnes

Oxford NIHR Biomedical Research Centre und Oxford University NHS Foundation Trust, Oxford, Großbritannien

Eleanor Barnes, Paul Klenerman und Susanna J. Dunachie

Institut für Immunologie und Immuntherapie, College of Medical and Dental Science, University of Birmingham, Birmingham, Großbritannien

Alex Richter

University Hospitals Birmingham NHS Foundation Trust, Birmingham, Großbritannien

Alex Richter

Abteilung für Tropen- und Infektionskrankheiten, Liverpool University Hospitals NHS Foundation Trust (Mitglied von Liverpool Health Partners), Liverpool, Großbritannien

Lanzenschildkröte

Abteilung für translationale Gastroenterologie, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

Paul Klenerman

Mahidol-Oxford Tropical Medicine Research Unit, Mahidol University, Bangkok, Thailand

Susanna J. Dunachie

Thema „Impfstoffe und Immunität“, Abteilung des Medical Research Council The Gambia an der London School of Hygiene and Tropical Medicine, Banjul, Gambia

Alsohan I. de Silva

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Konzeptualisierung: TdS, SJD, LT, PK, CJAD, RPP, SLRJ, MC, AR, EB Methodik: TdS, SJD, LT, PK, CJAD, RPP, MC, AR, EB, SL, HH, GS Formale Analyse: HH , ARN, SL, CL, AT, AA, BK, MGR, TdS, RPP Untersuchung: HH, ARN, SL, CL, AT, AA, BK, JKT, TT, PZ, MGR, PS, MS, PA, IN, MA, NAB, JMN, LG, SS, IG, TR, SCM, LMH, SLD, SB Ressourcen: AB, LT, EB Datenkuration: HH, TdS, RPP Schreiben – Originalentwurf: HH, TdS. Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung: HH, ARN, SL, AA, NAB, SB, TD, EB, LT, SLRJ, MC, CJAD, PK, SJD, RPP, TdS Visualisierung: HH, AA, ARN, RPP, TdS Aufsicht: CL, BK, AA, TD, JM, TL, DW, VH, SH, EB, GS, AR, LT, SLRJ, MC, CJAD, PK, SJD, RPP, TdS Fördermittelakquise: PK, SJD, LT, TdS, CJAD, AR, SH, VH

Korrespondenz mit Paul Klenerman oder Thosehan I. de Silva.

SJD ist wissenschaftliche Beraterin des schottischen Parlaments zu COVID-19, wofür sie ein Honorar erhält. Die Universität Oxford ist eine gemeinsame Partnerschaft zur Entwicklung von COVID-19-Impfstoffen mit AstraZeneca eingegangen. GS sitzt im wissenschaftlichen Beirat von GSK Vaccines und ist Gründungsmitglied von RQ Biotechnology. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt Christoph Neumann-Haefelin, Bianca Schulte und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Hornsby, H., Nicols, AR, Longet, S. et al. Eine Omicron-Infektion nach der Impfung verstärkt ein breites Spektrum an Immunreaktionen, abhängig von der Infektionsgeschichte. Nat Commun 14, 5065 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40592-4

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Eingegangen: 17. Februar 2023

Angenommen: 02. August 2023

Veröffentlicht: 21. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40592-4

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