Ein Heparin

Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 277 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Durch Plasmodium-Arten verursachte Malaria stellt weltweit ein großes Gesundheitsproblem dar, und die Infektion mit einem Malariaparasiten wird durch den Speichel weiblicher Anopheles-Mücken auf den Menschen übertragen. Die Invasion von Plasmodien ist ein schneller und komplexer Prozess. Ein entscheidender Schritt bei der Infektion von Malariaparasiten im Blutstadium ist die Adhäsion von Merozoiten an rote Blutkörperchen (RBCs), die Wechselwirkungen zwischen Parasitenliganden und Rezeptoren beinhaltet. Ziel der vorliegenden Studie war es, ein bisher nicht charakterisiertes Protein, PbMAP1 (kodiert durch PBANKA_1425900), zu untersuchen, das die Anheftung und Invasion von Plasmodium berghei ANKA (PbANKA)-Merozoiten über den Heparansulfatrezeptor erleichtert.

Die Expression des PbMAP1-Proteins wurde im asexuellen Blutstadium untersucht und seine spezifische Bindungsaktivität sowohl an Heparansulfat als auch an Erythrozyten wurde mithilfe von Western Blot, Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie analysiert. Darüber hinaus wurde mithilfe der Double-Crossover-Methode ein PbMAP1-Knockout-Parasitenstamm etabliert, um dessen Pathogenität bei Mäusen zu untersuchen.

Das PbMAP1-Protein, das im Merozoitenstadium hauptsächlich in der P. berghei-Membran lokalisiert ist, ist an der Bindung an den Heparansulfat-ähnlichen Rezeptor auf der Erythrozytenoberfläche während der Merozoiteninvasion beteiligt. Darüber hinaus zeigten Mäuse, die mit dem PbMAP1-Protein immunisiert oder passiv mit Seren von PbMAP1-immunisierten Mäusen immunisiert wurden, eine erhöhte Immunität gegen tödliche Herausforderungen. Der PbMAP1-Knockout-Parasit zeigte eine verringerte Pathogenität.

PbMAP1 ist an der Bindung von P. berghei an Heparansulfat-ähnliche Rezeptoren auf der Erythrozytenoberfläche während der Merozoiteninvasion beteiligt.

Malaria ist nach wie vor eine der häufigsten tödlichen Krankheiten der Welt. Jedes Jahr werden weltweit mindestens 241 Millionen Malariafälle und 627.000 Malaria-Todesfälle registriert [1]. Das Wachstum und die Vermehrung von Plasmodium-Parasiten in roten Blutkörperchen (RBCs) und das Aufplatzen infizierter Erythrozyten (iRBCs) sind für die meisten Malariasymptome verantwortlich [2]. Daher ist das Blutstadium der Parasiten das primäre Angriffsziel. Der Prozess der Erythrozyteninvasion durch die Merozoiten umfasst vier kontinuierliche Schritte: Anheftung eines Merozoiten an die Erythrozytenoberfläche, gefolgt von einer apikalen Neuausrichtung, der Bildung enger Verbindungen und der endgültigen Invasion [3]. Da die Adhäsion eines Merozoiten an der RBC-Oberfläche für eine vollständige Invasion von wesentlicher Bedeutung ist, ist es logisch anzunehmen, dass auf der Merozoitenoberfläche präsentierte Moleküle bei diesem Prozess eine entscheidende Rolle spielen. Bisher wurde gezeigt, dass mehrere Merozoiten-Oberflächenproteine ​​sowie von Rhoptry und Mikronemen abgeleitete Proteine ​​eine Rolle im Invasionsprozess spielen [4]. Viele Proteine ​​sind jedoch mit der Erythrozyteninvasion verbunden, deren Funktionen noch weiter erforscht werden müssen.

Heparansulfat (HS), ein unverzweigtes Polysaccharid von Glykosaminoglykanen (GAGs), die weit auf der Oberfläche von Wirbeltierzellen verteilt sind, wird von Apicomplexan-Parasiten genutzt, um in Wirtszellen einzudringen [5,6,7,8,9,10, 11]. Über die Adhäsion von Toxoplasma gondii-Oberflächenantigenen und sekretierten Proteinen an Wirtszellen über Heparin/HS wurde berichtet. Insbesondere binden mit der Invasion von T. gondii in Zusammenhang stehende Proteine ​​wie Oberflächenprotein 1 (SAG1), Rhoptry-Protein 2 (ROP2), ROP4 und Dense Granule Antigen 2 (GRA2) Heparin [12]. HS ist ein essentieller Rezeptor für Plasmodium falciparum, der Erythrozyten vor der Invasion erkennt. HS fungiert auch als Rezeptor für P. falciparum Erythrozytenmembranprotein 1 (PfEMP1), einen virulenten Parasitenfaktor, der mit der Rosettenbildung verbunden ist und an normalen Erythrozyten haften kann [13, 14]. Darüber hinaus wurde berichtet, dass P. falciparum-Merozoiten-Oberflächenprotein 1 (PfMSP-1), Retikulozyten-bindendes Homolog (PfRH5) und Erythrozyten-bindendes Protein (PfEBA-140) an HS auf der Oberfläche von Erythrozyten binden und dadurch zerstört werden Heparin [11, 15, 16]. Darüber hinaus hemmt HS die Invasion von Erythrozyten durch Plasmodium berghei [17]. Allerdings sind viele Proteine, die auf der Oberfläche des P. berghei-Merozoiten exprimiert werden und mit HS interagieren, nach wie vor nur unzureichend charakterisiert.

In der vorliegenden Studie haben wir ein neues Protein (PbMAP1) auf der Oberfläche von P. berghei identifiziert, das Heparin und HS bindet. Die Spezifität der PbMAP1-Bindung an HS auf der Oberfläche von Erythrozyten wurde charakterisiert. PbMAP1-spezifische Antikörper hemmten die Parasiteninvasion. Parasiten mit Gen-Deletion zeigten bei Mäusen eine verringerte Pathogenität. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass PbMAP1 eine entscheidende Rolle bei der Merozoiteninvasion von Erythrozyten spielt.

Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 6–8 Wochen wurden von der Liaoning Changsheng Biological Technology Company (Benxi, China) gekauft und nach einem Standardprotokoll in einem Tierlabor gehalten. Alle Tierversuche wurden gemäß den institutionellen Richtlinien der Shenyang Agricultural University, China (ethische Zulassung Nr. SYXK < Liao > 2021-0010) durchgeführt.

Parasiten wurden aus gefrorenen infizierten Erythrozytenbeständen revitalisiert und durch die Infektion von BALB/c-Mäusen durch intraperitoneale (IP) Injektion von 1 × 106 parasitierten Erythrozyten pro Maus aufrechterhalten, wie zuvor beschrieben [18]. Die Parasitämie des peripheren Blutes wurde anhand von Giemsa-gefärbten dünnen Blutausstrichen beurteilt.

Um Gene zu identifizieren, die potenzielle Merozoiten-Oberflächenproteine ​​codieren, haben wir die PlasmoDB-Malaria-Datenbank nach Proteinen durchsucht, die in Merozoiten mit einem mutmaßlichen Signalpeptid oder einer externen oder mindestens einer Transmembrandomäne exprimiert werden (19). Wir haben PBANKA_1425900 identifiziert, das ein mutmaßliches Protein von 154 kDa namens PbMAP1 kodiert. PbMAP1 (PBANKA_1425900) und orthologe Sequenzen in Plasmodium yoelii (PY17X_1428000), P. chabaudi (PCHAS_1427700), P. vinckei (PVSEL_1402900), P. falciparum (PF3D7_0811600), P. ovale (PocGH01_1403600). 0), P. malariae (PMALA_030180), P . gaboni (PGSY75_0811600) und P. reichenowi (PRCDC_0810900) wurden durch Suche in der PlasmoDB-Datenbank erhalten. Sequenzähnlichkeiten wurden mit DNAMAN 6 (Lynnon Corp., USA) bestimmt.

Das für PbMAP1 kodierende Gen wurde mittels RT-PCR mit Gesamt-RNA kloniert, die aus mit P. berghei infizierten Erythrozyten isoliert wurde. Das amplifizierte Produkt wurde in den Expressionsvektor pGEX-4T-1 kloniert. Das GST-markierte rekombinante Protein wurde in BL21 (DE3)-Zellen exprimiert und das lösliche Protein wurde unter Verwendung von Glutathion-Sepharose (GE Healthcare) mittels Affinitätsreinigung gereinigt.

Gereinigte GST-PbMAP1- und GST-Proteine ​​(5 nmol) wurden mit 40 μl Heparin-Sepharose-Perlen gemischt und 2 Stunden bei 4 °C inkubiert. Die Perlen wurden sieben Mal mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und 5 Minuten lang bei 4 °C und 500 × g zentrifugiert. Die Pellets wurden in 1× SDS-PAGE-Ladepuffer gekocht, um die Heparin-Bindungsaktivität durch Western Blot zu analysieren. Als Kontrolle wurde Sepharose verwendet.

Um die spezifische Affinität zwischen dem Protein und Heparin zu analysieren, wurden 5 nmol GST-PbMAP1 mit 50 μl Heparin oder Chondroitinsulfat A (CSA, Sigma Aldrich, USA) in verschiedenen Konzentrationen (10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 und 0,0001) inkubiert mg ml-1) für 30 Min. bei 4 °C. Anschließend wurden der Mischung nach und nach 40 μl Heparin-Sepharose-Kügelchen zugesetzt und 2 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Abschließend wurden die Heparin-Sepharose-Perlen siebenmal mit PBS gewaschen und 5 Minuten lang bei 4 °C und 500 × g zentrifugiert. Der Effekt der Konkurrenz wurde mittels Western Blot analysiert. Heparin-Bindungs- und Konkurrenztests wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt [20].

Affinitätsgereinigtes GST-PbMAP1 und das GST-Kontrollprotein wurden jeweils mit Maus-Erythrozyten (7 μl gepacktes Volumen) in PBS (pH 7,4) 1 Stunde lang bei 37 °C (Endvolumen 1 ml) inkubiert [21]. Das Erythrozytenpellet wurde siebenmal in 1 ml PBS gewaschen und die an die Erythrozyten gebundenen Proteine ​​wurden mit Western Blot unter Verwendung von GST-mAb (1:3000; TransGen) analysiert.

Um die Bindung von PbMAP1 an Maus-Erythrozyten weiter zu bestätigen, wurden frisch gesammelte Erythrozyten in PBS gewaschen, in RPMI (20 % Hämatokrit) resuspendiert und mit Methanol (20–30 s) als dünner Ausstrich auf Objektträgern fixiert. Die fixierten Erythrozyten wurden in PBS gewaschen, 1 Stunde lang bei 37 °C mit 3 % Rinderserumalbumin (BSA) blockiert, erneut gewaschen (5 Mal, jeweils 10 Minuten) und mit 5 nmol GST-PbMAP1 oder 5 nmol GST in inkubiert 3 % BSA für 2 Stunden bei 37 °C. Objektträgerproben wurden fünfmal mit PBS gewaschen, mit Ziegen-Anti-GST-Antikörper (1:3000; TransGen) inkubiert, fünfmal gewaschen und mit Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) (1:500; Sigma) inkubiert ). Hochauflösende Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (Leica Microsystems) aufgenommen. Die mittlere Fluoreszenzintensität der Erythrozyten wurde mit dem Durchflusszytometer FACSAria III (BD Biosciences) bestimmt.

Ein Peptid (CLYKSFKFVPPKKKLTDYFEEMFSDHKVEYDSLENVSKQL) aus dem PbMAP1-Protein wurde von Sangon Biotech synthetisiert. Ratten und Mäuse wurden immunisiert, um polyklonale Antikörper zu erhalten. Für die erste Immunisierung wurden 50 μg Peptid pro Maus, emulgiert mit vollständigem Freund-Adjuvans, subkutan injiziert, gefolgt von drei Immunisierungen mit 50 μg Peptid pro Maus, emulgiert mit unvollständigem Freund-Adjuvans, in Abständen von zwei Wochen zwischen den Injektionen. Den Mäusen in der Kontrollgruppe wurde Freunds Adjuvans injiziert. Die Antikörpertiter wurden mittels ELISA bewertet. Kurz gesagt, um Mikrotiterplatten mit rekombinantem PbMAP1 zu beschichten, wurden 50 μl der vorbereiteten PbMAP1-Arbeitsproteinlösung in jede Vertiefung einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen gegeben (0,5 μg PbMAP1/Vertiefung). Die Platte wurde über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurde die ungebundene PbMAP1-Beschichtungslösung verworfen und die Vertiefungen dreimal mit 200 μl PBST gewaschen. Die verbleibenden Proteinbindungsstellen in den beschichteten Vertiefungen wurden durch Zugabe von 50 μl 3 % BSA pro Vertiefung der Mikrotiterplatte blockiert und 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde die Platte nach dreimaligem Waschen mit 50 μl verdünnten Serumproben (1:500, 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:8000, 1:16.000 und 1:32.000) bei 37 °C inkubiert für 1 Stunde für die Bindungsreaktion, gefolgt von 50 μl HRP-Anti-Maus-IgG-Antikörpern im Dunkeln bei 37 °C für 1 Stunde. Die ungebundenen HRP-Anti-Maus-IgG-Antikörper wurden fünfmal mit 200 μl PBST gewaschen. Für die Substratreaktion wurden 100 μl 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) in jede Vertiefung gegeben und im Dunkeln bei 37 °C 15 Minuten lang inkubiert, um die blaue Farbe zu entwickeln. Im nächsten Schritt wurden 50 μl 2M H2SO4 in jede Vertiefung gegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die Absorption wurde mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät bei 450 nm unmittelbar nach der Zugabe von 2 M H2SO4 abgelesen. Die Antikörper für die Proben wurden mit der folgenden Formel bestimmt: Titer = (optische Dichte [OD]-Werte der Probe – OD-Werte der Blindkontrolle)/(OD-Werte der Negativkontrolle – OD-Werte der Blindkontrolle).

Infizierte Erythrozytenausstriche wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in Methanol fixiert. Die Zellen wurden mit einem hydrophoben PAP-Stift markiert und fünfmal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit 3 % BSA blockiert. Primäre Anti-PbMAP1-Antikörper (1:50) wurden in 3 % BSA verdünnt und zu den Objektträgern gegeben. Die Zellen wurden über Nacht bei 4°C inkubiert und anschließend fünfmal mit PBS gewaschen. Als nächstes wurden den Objektträgern sekundäre Anti-Ratten-Alexa-Fluor-488-Antikörper (1:500) (Thermo Fisher Scientific) hinzugefügt. Die Zellen wurden 30 Minuten bei 37 °C inkubiert und dann fünfmal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit ProLong Diamond Antifade Mountant mit DAPI (Thermo Fisher Scientific) montiert und unter einem Fluoreszenzmikroskop (Leica) analysiert.

In passiven Immunisierungstests wurden jeder Maus 24 Stunden zuvor 500 μl Seren von peptidimmunisierten Mäusen intravenös (IV) injiziert. Nach 24-stündiger Belastung mit 1 × 106 iRBCs wurden jeder Maus erneut 500 μl Seren von peptidimmunisierten Mäusen intravenös injiziert. Parasitämie wurde wie oben beschrieben gemessen und gezählt.

Wir haben die Double-Crossover-Methode verwendet, um einen PbMAP1-Knockout-Stamm zu erzeugen, wie zuvor beschrieben [22]. Das Plasmid wurde unter Verwendung von pl0001 (MR4; ATCC, USA) konstruiert. Die 5'- und 3'-untranslatierten Regionen (UTRs) von PbMAP1 wurden als linker oder rechter homologer Arm PCR-amplifiziert und stromaufwärts bzw. stromabwärts des DHFR-Gens eingefügt. Die 5'-UTR und 3'-UTR wurden unter Verwendung von Restriktionsenzymstellen (Apa I/BspD I oder BamH I/Not I) in das pl0001-Plasmid subkloniert.

Um das PbMAP1-Gen wieder in den Knockout-Stamm (ΔPbMAP1) einzuführen, wurde das CRISPR/Cas9-Plasmid pYCm (ein Geschenk von Prof. Jing Yuan, Universität Xiamen) verwendet und im ΔPbMAP1-Stamm ein parasitärer Stamm mit einem rekonstruierten PbMAP1-Gen erzeugt . Oligonukleotide für Leit-RNA (sgRNA) wurden mit dem Eukaryotic Pathogen CRISPR Guide RNA/DNA Design Tool (http://grna.ctegd.uga.edu/) entworfen und in das pYCm ligiert. Die Mutagenese wurde mit dem Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit (NEB, E0552) durchgeführt. Insbesondere wurden die 5'-UTR und 3'-UTR (400 bis 700 bp) der Zielgene als linke oder rechte homologe Arme unter Verwendung spezifischer Primer (Zusatzdatei 1: Tabelle S1) amplifiziert und in die Restriktionsstellen in pYCm eingefügt.

Plasmodium berghei wurde wie zuvor beschrieben transfiziert [22]. Zwei BALB/c-Mäusen wurden intraperitoneal Erythrozyten von mit P. berghei infizierten Mäusen injiziert (1–4 Tröpfchen mit 5–15 % Parasitämie). Sobald die Parasitämie zwischen 1 % und 3 % lag, wurden die Parasiten gesammelt und in vitro zu reifen Schizonten in RPMI 1640 mit 20 % FBS kultiviert. Insgesamt 5 μg lineares Plasmid (verdaut mit Kpn I und Sac II) wurden mit 1 × 107 Schizonten gemischt, die mit 60 % Nycodenz (AXIS-SHIELD) gereinigt wurden. Die Mischung wurde in eine Elektroporationsküvette überführt und mit Gene Pulser II (Bio-Rad) bei 800 V und 25 μF Kapazität gepulst. Den transfizierten Parasiten wurden sofort 100 μl vollständiges Kulturmedium zugesetzt und die Suspension wurde einer anderen BALB/c-Maus intravenös injiziert. Den Mäusen wurde 1 Tag nach der Infektion mit transfizierten Parasiten (mit Knockout-Plasmiden) Trinkwasser mit Pyrimethamin (70 μg ml-1) verabreicht. Pyrimethamin wurde 4–9 Tage lang verabreicht, bis infiziertes Blut entnommen wurde. Zusätzlich wurde 3 Tage nach der Infektion mit transfizierten Parasiten (mit komplementiertem Plasmid) eine Einzeldosis von 0,1 ml WR99210 (16 mg kg-1 Körpergewicht bei Mäusen mit einem Gewicht von 20 g) verabreicht. Zur PCR-Analyse wurde genomische DNA aus Parasiten extrahiert. Mit der Methode der limitierenden Verdünnung wurden Parasitenklone mit den richtigen Modifikationen erhalten. Positive Klone wurden mittels PCR, Western Blot und IFA getestet. Die für die Genotypisierung verwendeten Primer sind in der Zusatzdatei 1: Tabelle S1 aufgeführt.

Das Southern-Blotting von PbMAP1- und ΔPbMAP1-Parasiten wurde mit dem DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit (Roche) gemäß dem Produkthandbuch durchgeführt. Kurz gesagt, genomische DNA wurde 1 Stunde lang bei 37 °C mit Hind III verdaut und auf einem 0,8 %igen Agarosegel zum Southern-Blotting auf eine Hybond N+-Nylon-Transfermembran (Millipore) aufgetrennt. Die Ziel-gDNA-Banden wurden mit einer zu PbMAP1 komplementären Digoxigenin-markierten DNA-Sonde hybridisiert und unter Verwendung eines Anti-Digoxigenin-AP-konjugierten Antikörpers nachgewiesen. Die für die Sondenamplifikation verwendeten Primer sind in der Zusatzdatei 1: Tabelle S1 aufgeführt.

Um die Infektiosität von Wildtyp-P. berghei und geneditierten Stämmen zu vergleichen, wurden 90 weibliche BALB/c-Mäuse zufällig in neun Gruppen zu je 10 Mäusen aufgeteilt und ihnen intraperitoneal spezifische Dosen verabreicht (1 × 103, 1 × 104 oder …). 1 × 106) der Stämme P. berghei Wildtyp (WT), ΔPbMAP1 (Knockout-Stamm) oder ReΔPbMAP1 (Gen-Rekomplement-Stamm). Die Parasitämie wurde täglich durch Zählen der Zellen in mit Giemsa gefärbten Abstrichen aus einem Schwanzblutstropfen beurteilt. Das Überleben der Tiere wurde täglich überwacht.

Die Parasiten wurden aus dem Blut von BALB/c-Mäusen gewonnen, die mit WT- oder ΔPbMAP1-Stämmen infiziert waren. Die Gesamt-RNA wurde mit dem TRIzol-Reagenz (Invitrogen) aus den Parasitenpellets extrahiert [23], in RNase-freiem reinem Wasser gelöst und mit einem NanoDrop-Spektrophotometer (Nanodrop 2000/2000c) quantifiziert. Erststrang-cDNA wurde aus zufälligen Primermischungen unter Verwendung von PrimeScript RT Enzyme Mix I (Takara) gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Spezifische Primer (Zusatzdatei 1: Tabelle S1) wurden entwickelt, um die mRNA-Transkription bestimmter Gene nach PbMAP1-Knockout nachzuweisen. Die Zyklusbedingungen waren wie folgt: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 30 s, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 5 s, Tempern bei 60 °C für 30 s und Verlängerung bei 72 °C für 30 s. Das Housekeeping-Gen Actin (PBANKA_1459300) wurde verwendet, um das Transkriptionsniveau jedes Gens zu normalisieren.

Die Konzentrationen von IFN-γ, TNF-α, MCP-1, CCL4, IL-6, IL-10 und IL-12p70 in Mäuseseren wurden mit dem Cytmetric Bead Array Mouse Inflammation Kit (BD Biosciences) bestimmt. Die Proben wurden gemäß dem Standardprotokoll (BD Biosciences) untersucht und mit dem FACSAria III-Durchflusszytometer (BD Biosciences) untersucht, das von der FACSDiva-Software (BD Biosciences) gesteuert wurde.

Das für PbMAP1 kodierende Gen befindet sich auf Chromosom 14 und kodiert für ein Protein mit 1303 Aminosäuren, das vermutlich ein Signalpeptid am N-Terminus enthält (Abb. 1A). Die Aminosäuresequenz von PbMAP1 ist bei allen Plasmodium-Arten relativ konserviert, mit > 70 % Identität zwischen P. yoelii-, P. chabaudi- und P. vinckei-Orthologen, > 40 % Identität bei Arten, die Menschen infizieren (einschließlich des zoonotischen P. knowlesi). und > 43 % Identität mit Arten, die Affen infizieren (Abb. 1B, 1C).

Sequenzanalyse von PbMAP1. Ein PbMAP1 ist 1303 Aminosäuren lang und enthält voraussichtlich ein Signalpeptid. B Identität in der Aminosäuresequenz zwischen PbMAP1 und orthologen Sequenzen anderer Plasmodium-Arten. C Ausrichtung der Aminosäuresequenz von PbMAP1 mit Orthologen von Plasmodium-Arten (Sequenzidentitäten sind im Abschnitt „Methoden“ aufgeführt). Die mutmaßlichen Heparin-Bindungsmotive in den Sequenzen sind im roten Kasten hervorgehoben

Um die Eigenschaften der Bindung von PbMAP1 an Heparin zu demonstrieren, wurde das rekombinante Protein GST-PbMAP1 gereinigt. GST-PbMAP1 konnte an Heparin-Sepharose binden, jedoch nicht an Sepharose, wohingegen GST nicht an Heparin binden konnte (Abb. 2A). Der kompetitive Hemmungstest ergab, dass mit zunehmender Heparinkonzentration die Bindungsmenge von GST-PbMAP1 an Heparin allmählich abnahm (Abb. 2B); Bei einem Anstieg der CSA-Konzentration wurde jedoch keine signifikante Veränderung der Bindung von GST-PbMAP1 an Heparin festgestellt (Abb. 2C).

GST-PbMAP1 bindet spezifisch an Heparin. Eine Heparin-bindende Aktivität wurde mittels Western Blot mit Anti-GST-Antikörper nachgewiesen. GST-PbMAP1 konnte Heparin-Sepharose binden, nicht jedoch Sepharose. GST konnte Heparin-Sepharose nicht binden. B Die kompetitive Hemmung wurde mittels Western Blot mit einem Anti-GST-Antikörper nachgewiesen. Mit zunehmender Heparinkonzentration nahm die Bindung von GST-PbMAP1 an Heparin-Sepharose allmählich ab. C Mit steigender CSA-Konzentration wurden keine signifikanten Veränderungen in der GST-PbMAP1-Bindung mit Heparin-Sepharose festgestellt

GST-PbMAP1 und GST wurden mit Erythrozyten inkubiert und mittels IFA, Western Blot und Durchflusszytometrie analysiert. IFA zeigte, dass die mit GST-PbMAP1 inkubierten Erythrozyten eine spezifische grüne Fluoreszenz auf der Oberfläche zeigten, wohingegen die mit GST allein inkubierten Erythrozyten keine Fluoreszenz zeigten (Abb. 3A). Western Blot zeigte, dass für mit GST-PbMAP1 inkubierte Erythrozyten spezifische Zielbanden nachgewiesen wurden, während für mit GST allein inkubierte Erythrozyten keine Banden nachgewiesen wurden (Abb. 3B). Die Bindung von GST-PbMAP1 an Erythrozyten wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert und die Ergebnisse bestätigten, dass PbMAP1 an Erythrozyten binden konnte (Abb. 3C). Daher könnte PbMAP1 an die Oberfläche von Erythrozyten binden.

GST-PbMAP1 bindet an Maus-Erythrozyten. Ein indirekter Immunfluoreszenztest mit einem Anti-GST-Antikörper als Primärantikörper und Alexa Fluor 488 Goat Anti-Maus-IgG (H+L) als Sekundärantikörper zeigt die Bindung von GST-PbMAP1 an Erythrozyten. Als Kontrolle wurde GST verwendet. Maßstabsbalken, 5 μm. B Western Blot mit einem Anti-GST-Antikörper zeigt die Bindung von GST-PbMAP1 an Erythrozyten. C Zelldurchflusszytometrie-Analyse der Erythrozytenbindung durch GST-PbMAP1 mit GST als Kontrolle. Bei GST-PbMAP1-gebundenen Erythrozyten ist eine deutliche Verschiebung zu beobachten. D Die Fluoreszenzintensität von mit GST-PbMAP1 gebundenen Erythrozyten im Vergleich zu der mit GST und Blindkontrollen

Um die Lokalisierung von PbMAP1 in Merozoiten zu untersuchen, wurden Western Blot, IFA und Immunelektronenmikroskopie unter Verwendung von PbMAP1-spezifischen Antikörpern durchgeführt. Western Blot bestätigte die PbMAP1-Expression in Merozoiten. Als nächstes analysierten wir die Expression und Lokalisierung von PbMAP1 mithilfe von IFA. Auf der Oberfläche freier Merozoiten und der Schizonten wurde Fluoreszenz beobachtet. Die Immunelektronenmikroskopie bestätigte außerdem, dass sich PbMAP1 hauptsächlich auf der Plasmamembran befand (Abb. 4A – C).

PbMAP1 wird in Merozoiten exprimiert. Ein Western-Blot von nativem PbMAP1, exprimiert in Plasmodium berghei-Merozoiten, nachgewiesen unter Verwendung von PbMAP1-spezifischen Antikörpern. B Indirekte Immunfluoreszenz von PbMAP1. Freie Merozoiten und Parasiten im Ring-, Trophozoiten- und Schizontenstadium wurden fixiert und die PbMAP1-Expression wurde mit Anti-PbMAP1-IgG (grün) nachgewiesen. Parasitenkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. C Immunelektronenmikroskopische Bilder von PbMAP1. Die Goldpartikel waren auf der Merozoitenmembran lokalisiert. Maßstabsbalken, 500 nm

In diesem Assay wollten wir feststellen, ob PbMAP1-spezifische Antikörper den Wirt in vivo vor parasitären Infektionen schützen. BALB/c-Mäuse (N = 10 pro Gruppe) wurden viermal mit spezifischen Peptiden immunisiert. Den Mäusen mit hohen Antikörpertitern wurden 1 × 106 iRBCs injiziert und ihre Überlebenszeit und Parasitämie wurden gemessen. Die mit spezifischen Peptiden immunisierten Mäuse zeigten eine deutlich längere Überlebenszeit (Abb. 5A, B). Darüber hinaus wurde Hyperimmunserum gesammelt und BALB/c-Mäusen intravenös injiziert, gefolgt von der Injektion von 1 × 106 iRBCs. Das Überleben der Mäuse, denen Anti-PbMAP1-Serum injiziert worden war, war deutlich länger als das der Kontrollmäuse. Daher könnten PbMAP1-Antikörper die Invasion von Parasiten hemmen und immunschützende Wirkungen hervorrufen (Abb. 5C, D).

PbMAP1-spezifische Antikörper erzeugten eine schützende Immunität gegen Plasmodium berghei ANKA. A, B BALB/c-Mäuse ohne jegliche Immunisierung (Kontrolle) zeigten am 11. Tag nach der Infektion eine 1,70-fach höhere Parasitämie als mit PbMAP1-Peptid immunisierte Mäuse; Die Fehlerbalken zeigen SD an. Mit PbMAP1-Peptiden immunisierte Mäuse überlebten 6 Tage länger als Kontrollmäuse. C, D Mäuse, denen Serum einer normal infizierten Maus injiziert wurde, zeigten am 11. Tag nach der Infektion eine 1,86-fach höhere Parasitämie als diejenigen, denen Anti-PbMAP1-Seren injiziert wurden. Verglichen mit der normalen Mäuseserumgruppe überlebte die Anti-PbMAP1-Serumgruppe 6 Tage länger; Die Fehlerbalken zeigen SD an

Etablierung eines PbMAP1-Knockout-Stammes (ΔPbMAP1).

Wir untersuchten, ob PbMAP1 ein Schlüsselfaktor für die Bindung an die Oberfläche von Erythrozyten ist, indem wir das PbMAP1-Gen aus dem Parasiten ausschalteten (Abb. 6A). Der Knockout-Stamm (ΔPbMAP1) wurde kloniert und mittels PCR mit spezifischen Primern verifiziert (Abb. 6B). Darüber hinaus bestätigte der Western-Blot die praktisch vollständige Deletion von PbMAP1 (Abb. 6C), und im Southern-Blot war im ΔPbMAP1-Stamm kein Signal nachweisbar (Abb. 6D).

Konstruktion eines PbMAP1-Knockout-Stammes (ΔPbMAP1). Ein Schema des Transfektionsplasmids, das zum Targeting und Ausschalten von PbMAP1 im PbANKA-Stamm mithilfe der Double-Crossover-Methode verwendet wird. B PCR-Validierung der PbMAP1-Deletion. PCR-Produkte von 5'-UTR, 3'-UTR und PbMAP1 zeigten, dass PbMAP1 durch DHFR ersetzt wurde. C Western Blot der PbMAP1-Expression in WT und ΔPbMAP1. Es werden Proteinbanden mit erwarteten Molekulargewichten angezeigt. Im Knockout-Stamm wurde kein PbMAP1-Protein nachgewiesen. Als Kontrolle wurde GAPDH verwendet. D Southern Blot unter Verwendung einer DNA-Sonde aus dem PbMAP1-Gen in WT und ΔPbMAP1. Das für PbMAP1 kodierende Gen wurde im Knockout-Stamm vollständig gelöscht

Um zu zeigen, dass der Phänotypdefekt auf die Deletion des für PbMAP1 kodierenden Gens zurückzuführen ist, haben wir das PbMAP1-Gen ohne Intron am endogenen PbMAP1-Locus im ΔPbMAP1-Parasiten wieder eingeführt (Abb. 7A). Der genkomplementierte Parasit (ReΔPbMAP1) wurde kloniert und mittels PCR mit spezifischen Primern verifiziert (Abb. 7B). Western Blot und IFA bestätigten auch die PbMAP1-Expression im ReΔPbMAP1-Stamm (Abb. 7C, D).

Konstruktion des PbMAP1-komplementierten Stamms (ReΔPbMAP1). Ein Schema des Transfektionsplasmids, das zum Targeting und Wiedereinführen des PbMAP1-Gens in ΔPbMAP1 mithilfe der CRISPR/Cas9-Methode verwendet wird. B PCR-Validierung der PbMAP1-Wiedereinführung. PCR-Produkte von 5′-UTR, 3′-UTR und PbMAP1 zeigten, dass PbMAP1 wieder eingeführt wurde. C Western Blot der PbMAP1-Expression in ΔPbMAP1 und ReΔPbMAP1. Im ΔPbMAP1-Stamm wurde keine Proteinbande mit dem erwarteten Molekulargewicht nachgewiesen, im ReΔPbMAP1-Stamm jedoch; Als Kontrolle wurde GAPDH verwendet. D IFA unter Verwendung von Ratten-Anti-PbMAP1-IgG zum Nachweis der PbMAP1-Expression. PbMAP1 wurde in WT und ReΔPbMAP1 nachgewiesen, jedoch nicht im ΔPbMAP1-Stamm

Um die Korrelation von PbMAP1 mit der Infektiosität des Parasiten zu untersuchen, infizierten wir Mäuse mit WT PbMAP1, ΔPbMAP1 oder ReΔPbMAP1 bei 1 × 106 Parasiten pro Maus. Das Schwanzblut wurde täglich nach der Infektion anhand von Giemsa-gefärbten Abstrichen analysiert. Dabei zeigte sich, dass der Grad der Parasitämie bei Mäusen, die mit den ΔPbMAP1-Parasiten infiziert waren, geringer war als bei Mäusen, die mit WT-Parasiten infiziert waren. Darüber hinaus wurde die Überlebenszeit dieser Mäuse überwacht. Mit ΔPbMAP1-Parasiten infizierte Mäuse starben 4–10 Tage später als mit WT infizierte Mäuse. Alle Mäuse starben an schwerer Anämie (Abb. 8A, B). Ein ähnliches Phänomen wurde bei Mäusen beobachtet, die mit WT, ΔPbMAP1 oder ReΔPbMAP1 infiziert waren, wenn sie mit 1 × 103 oder 1 × 104 Parasiten pro Maus infiziert waren (Abb. 8C–F).

Die PbMAP1-Deletion verringerte die Infektiosität von PbMAP1. A und B Parasitämie- und Überlebenskurven von BALB/c-Mäusen nach intraperitonealer Infektion mit 1 × 106 WT-, ΔPbMAP1- oder ReΔPbMAP1-Parasiten. C- und D-Parasitämie- und Überlebenskurven von BALB/c-Mäusen nach intraperitonealer Infektion mit 1 × 104 WT-, ΔPbMAP1- oder ReΔPbMAP1-Parasiten. E und F Parasitämie und Überlebenskurven von BALB/c-Mäusen nach intraperitonealer Infektion mit 1 × 103 WT-, ΔPbMAP1- oder ReΔPbMAP1-Parasiten.

Interessanterweise schien sich ihre Virulenz zu erholen, während sich die Parasiten weiter teilten und vermehrten. Um zu bestätigen, dass das Phänomen der Virulenzwiederherstellung das Ergebnis des PbMAP1-Knockouts war, wurde eine qRT-PCR an bestimmten Genen in den WT- und ΔPbMAP1-Parasiten durchgeführt (Abb. 9A). Im Vergleich zu WT zeigten PbMAP1-Knockout-Stämme deutlich erhöhte Transkriptmengen des MAEBL-Gens, das für das Merozoiten-adhäsive erythrozytische Bindungsprotein (MAEBL) kodiert, und deutlich herunterregulierte Transkriptmengen von 10 anderen Genen, was auf eine komplementäre Assoziation zwischen PbMAP1 und MAEBL schließen lässt. Western Blot zeigte, dass das Expressionsniveau des MAEBL-Proteins in ΔPbMAP1-Stämmen höher war als das in WT-Stämmen (Abb. 9B, C).

Transkriptionsanalyse von invasionsbezogenen Genen in den ΔPbMAP1-Parasiten mit qRT-PCR. Die Transkription von MAEBL war in ΔPbMAP1-Stämmen im Vergleich zum Wildtyp-Stamm deutlich hochreguliert. B und C Die Expression des MAEBL-Proteins in ΔPbMAP1-Stämmen korrelierte positiv mit den Transkriptionsniveaus. Die Experimente wurden dreimal wiederholt. Fehlerbalken stellen SD dar

Um den Einfluss von PbMAP1 auf das Ergebnis einer Infektion im Blutstadium zu untersuchen, infizierten wir Mäuse entweder mit WT- oder ΔPbMAP1-infizierten Erythrozyten bei 1 × 10 Parasiten pro Maus und charakterisierten die frühe Immunantwort bei WT- oder ΔPbMAP1-infizierten Mäusen. Wir haben an den Tagen 3, 5, 7, 10 und 15 nach der Infektion Seren gesammelt und die Proben auf die Expression verschiedener Zytokine und Chemokine untersucht (Abb. 10A). Die Serumspiegel von IFN-γ waren bei ΔPbMAP1-infizierten Mäusen höher als die Spitzenwerte bei den WT-infizierten Mäusen, und Spitzenwerte wurden am Tag 7 nach der Infektion aufgezeichnet (Abb. 10B). In ähnlicher Weise waren am Tag 7 nach der Infektion die Spiegel von TNF-α, IL-6 und IL-10 bei ΔPbMAP1-infizierten Mäusen höher (Abb. 10C–E). Umgekehrt waren am Tag 7 nach der Infektion die Spiegel von MCP-1 und CCL4 bei WT-infizierten Mäusen höher als bei ΔPbMAP1-infizierten Mäusen (Abb. 10F, G). Im Laufe der Infektionszeit glichen sich die CCL4-Spiegel in beiden Gruppen an und stiegen bis zum 10. Tag nach der Infektion weiter an. Ebenso stiegen die IL-12p70-Spiegel mit dem Fortschreiten der Infektion an, obwohl keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen festgestellt wurden (Abb. 10H).

Eine ΔPbMAP1-Infektion induzierte bei infizierten Mäusen stärkere IFN-γ- und TNF-α-Reaktionen. A-BALB/c-Mäuse wurden entweder mit ΔPbMAP1 oder WT unter Verwendung von 1 × 104 iRBCs pro Maus intraperitoneal infiziert. Die Parasitämie wurde während des Infektionsverlaufs überwacht. Jeder Kreis repräsentiert eine einzelne Maus. Die Analysen wurden mit fünf Tieren pro Gruppe durchgeführt. B–H-Seren, die zu verschiedenen Zeitpunkten von infizierten Mäusen gesammelt wurden. Zeitabhängige Veränderungen der Serumspiegel verschiedener Zytokine und Chemokine, quantifiziert mithilfe eines Bead-Arrays (BD). Jeder Kreis bezieht sich auf die Reaktion einer Maus und Linien geben Mittelwerte an. Statistisch signifikante Unterschiede werden mit Sternchen angezeigt (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001)

Die Invasion von Plasmodium in Erythrozyten ist ein schneller und komplexer Prozess, der die Adhäsion der Erythrozyten, die apikale Neuausrichtung, den Komplex der mobilen Verbindung sowie die Bildung und Modifikation der parasitophoren Vakuolenmembran (PVM) in einer Reihe dynamischer Schritte umfasst [24,25,26]. Zu den Schlüsselproteinen, die mit der Invasion von Erythrozytenparasiten in Zusammenhang stehen, gehören verschiedene Proteine, die sich auf der Merozoitenoberfläche, in Mikronemen, Rhoptrien und dichten Körnern befinden [27,28,29]. Wenn ein Merozoit in Erythrozyten eindringt, binden die Oberflächenproteine ​​des Parasiten an Erythrozyten-Oberflächenrezeptoren und erhöhen so die Kalziumkonzentration im Zytoplasma des Parasiten. Dies wiederum stimuliert die Sekretion von Mikronem-Proteinen wie TRAP, die eine wichtige Rolle bei der Gleitmotilität und Invasion spielen, was zu einer Reihe von Invasionsschritten führt [30,31,32,33,34]. Daher ist die Adhäsion für Plasmodium der erste Schritt, um in Erythrozyten einzudringen, und Proteine, die sich auf der Oberfläche von Merozoiten befinden, spielen eine entscheidende Rolle im Invasionsprozess. Spezifische Oberflächenproteine, die an Erythrozyten binden, wurden jedoch noch nicht vollständig charakterisiert, und diese Proteine ​​könnten wichtige Virulenzfaktoren im Infektionsprozess sein.

Glykosaminoglykane (GAGs) sind lange lineare Kohlenhydratketten, die an die Kernproteine ​​gebunden werden, um Proteoglykane zu bilden. HS ist ein GAG und umfasst abwechselnd Glucosamin- und Uronsäurereste in der wiederholten Disaccharideinheit (-4GlcAβ1-4GlcNAcα1-) [6, 14, 35]. HS ist auf der Zelloberfläche und in der extrazellulären Matrix vieler Gewebe lokalisiert und an mehreren Aspekten des Plasmodium-Lebenszyklus beteiligt [36, 37]. Somit ist HS der Hauptrezeptor für in Plasmodium eindringende Erythrozyten [38,39,40,41].

Frühe Studien berichteten, dass Peptide, die an Heparin binden können, ein oder mehrere konsistente Heparin-Bindungsmotive enthalten, nämlich [-XBBXBX-] oder [-XBBBXXBX-], wobei B der basische Rest basischer Aminosäuren wie Lysin, Arginin ist. und Histidin, und X ist ein hydrophiler Aminosäurerest [42]. Frühere Studien zu P. falciparum zeigten, dass die Bindung von PfEMP1 an den HS-Rezeptor auf Erythrozyten auf dem Vorhandensein mehrerer Heparin-Bindungsmotive in der DBLα-Region beruht [39]. In der vorliegenden Studie haben wir ein neues Protein, PbMAP1, identifiziert, das Heparin-bindende Motive enthält, was darauf hindeutet, dass PbMAP1 möglicherweise HS-ähnliche Rezeptoren binden kann. Daher wurde die Bindung von PbMAP1 an den Oberflächenrezeptor der Erythrozyten untersucht.

Insbesondere haben unsere IFA- und Elektronenmikroskopie gezeigt, dass PbMAP1 auf der Oberfläche von P. berghei exprimiert wird. Als Oberflächenprotein könnte PbMAP1 an der Interaktion zwischen dem Parasiten und den RBC-Oberflächenrezeptoren beteiligt sein. Basierend auf der dreidimensionalen (3D) Strukturmodellierung von PbMAP1 und seinen Heparin-Bindungsmotiven exprimierten und reinigten wir das rekombinante Protein GST-PbMAP1 in Escherichia coli und verwendeten das GST-Protein als Negativkontrolle zur Funktionsüberprüfung. Experimente zur Heparinbindung und kompetitiven Hemmung zeigten, dass GST-PbMAP1 konzentrationsabhängig an Heparin binden kann (Abb. 2). IFA, Western Blot und Durchflusszytometrie zeigten außerdem, dass das PbMAP1-Protein an die Oberfläche von Erythrozyten binden könnte (Abb. 3). Daher könnte PbMAP1 an der Bindung an den HS-ähnlichen Rezeptor auf der RBC-Oberfläche beteiligt sein.

Darüber hinaus wurde PbMAP1 ausgeschaltet, um seine Funktion zu beurteilen. Wir fanden heraus, dass die Pathogenität des ΔPbMAP1-Stammes bei Mäusen im Vergleich zu der des WT-Stamms abgeschwächt war (Abb. 8). Die Verwendung des PbMAP1-Knockout-Stammes zeigte außerdem die Rolle des PbMAP1-Proteins bei der Bindung an Erythrozyten. Darüber hinaus beobachteten wir, dass Mäuse, die mit PbMAP1-spezifischen Peptiden immunisiert wurden, einen Immunschutz erreichten (Abb. 5). Daher könnte PbMAP1 eine wichtige Rolle bei der Bindung und Invasion von P. berghei an Erythrozyten spielen. Interessanterweise stellten wir fest, dass mit der kontinuierlichen Replikation der Parasiten die Infektiosität des ΔPbMAP1-Parasiten wiederhergestellt schien. Daher haben wir spekuliert, dass es einige Möglichkeiten der Entschädigung geben könnte. Wir sammelten WT- und ΔPbMAP1-Stämme und suchten mithilfe von qRT-PCR nach Genen mit signifikanten Unterschieden in den Transkriptniveaus nach PbMAP1-Knockout. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass das Transkriptniveau von MAEBL deutlich hochreguliert war, während das Transkriptniveau von 10 anderen Merozoiten-Genen deutlich herunterreguliert war. Diese Ergebnisse bestätigten, dass PbMAP1-Knockout die MAEBL-Expression beeinflusste (Abb. 8).

Um den möglichen Mechanismus zu beurteilen, durch den die Injektion mit dem ΔPbMAP1-Stamm Mäusen Immunschutz verleihen kann, untersuchten wir Veränderungen der Zytokinspiegel nach der Immunisierung mit den ΔPbMAP1-Stämmen. Die Spiegel von IFN-γ, TNF-α, IL-6 und IL-10, die für die Aktivierung der schützenden Immunität wichtig sind, waren im Frühstadium der ΔPbMAP1-Infektion signifikant erhöht. Daher ist die PbMAP1-Expression wahrscheinlich für den Parasiten von Vorteil, da sie schützende Immunantworten im Wirt verhindert.

Die vorliegende Studie zeigte, dass das Oberflächenprotein PbMAP1 an der Bindung von P. berghei an den HS-Rezeptor auf der Erythrozytenoberfläche beteiligt ist. Das Fehlen von PbMAP1 ist vermutlich schädlich für den Parasiten, da es im Wirt eine spezifische Immunantwort hervorruft. Unsere Ergebnisse zeigten die Wechselwirkung zwischen PbMAP1, einem neuartigen Oberflächenprotein von P. berghei, und dem HS-ähnlichen Rezeptor während der Invasion. Gleichzeitig können diese Erkenntnisse nützliche Ansätze für eine umfassende Charakterisierung von P. falciparum-Proteinen bei menschlicher Malaria sein.

Die Datensätze, die die Schlussfolgerungen dieses Artikels unterstützen, sind im Artikel und seiner zusätzlichen Datei enthalten.

rote Blutkörperchen

Plasmodium berghei ANKA

Heparansulfat

Glykosaminoglykane

Merozoiten-Oberflächenprotein

Erythrozyten-bindende Antigene

Merozoiten-adhäsives Erythrozyten-Bindungsprotein

Intraperitoneal

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Heparansulfat

Chondroitinsulfat A

Roswell Park Memorial Institute

2′,6-Diamidino-2-phenylindol

Intravenös

Wildtyp

Interferon-Gamma

Tumornekrosefaktor Alpha

Interleukin

Monozyten-Chemoattraktiv-Protein-1

Makrophagen-Entzündungsprotein-1β

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Diese Arbeit wurde von der National Nature and Science Foundation of China (Zuschuss-Nr. 82030060) und dem CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) (Zuschuss-Nr. 2019-I2M-5-042) unterstützt.

Schlüssellabor für Infektionskrankheiten bei Nutztieren, Bildungsministerium, Schlüssellabor für Zoonose, Hochschule für Tierwissenschaften und Veterinärmedizin, Shenyang Agricultural University, 120 Dongling Road, Shenyang, 110866, China

Junying Gao, Ning Jiang, Yiwei Zhang, Ran Chen, Ying Feng, Xiaoyu Sang und Qijun Chen

Forschungseinheit für pathogene Mechanismen zoonotischer Parasiten, Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften, 120 Dongling Road, Shenyang, 110866, China

Junying Gao, Ning Jiang, Yiwei Zhang, Ran Chen, Ying Feng, Xiaoyu Sang und Qijun Chen

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JG führte die meisten Experimente durch, analysierte diese Daten und verfasste den ersten Entwurf des Manuskripts. NJ betreute alle experimentellen Arbeiten. YZ half bei der Parasitenvermehrung und der bioinformatischen Analyse. RC assistierte bei der immunologischen Analyse. YF unterstützte die Immunfluoreszenzexperimente. XS half bei den Zelladhäsionsexperimenten. QC konzipierte die Studie, analysierte die Daten und stellte das Manuskript fertig.

Korrespondenz mit Qijun Chen.

Alle Tierprotokolle und -verfahren wurden gemäß den Vorschriften der Tierethikkommission der Shenyang Agricultural University durchgeführt.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Primersequenzen, auf die in dieser Studie Bezug genommen wird.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Gao, J., Jiang, N., Zhang, Y. et al. Ein Heparin-bindendes Protein von Plasmodium berghei ist mit der Invasion von Erythrozyten durch Merozoiten verbunden. Parasites Vectors 16, 277 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05896-w

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Eingegangen: 30. April 2023

Angenommen: 23. Juli 2023

Veröffentlicht: 10. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05896-w

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