Neuroinvasion und Anosmie sind unabhängige Phänomene bei einer SARS-Infektion

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4485 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Anosmie wurde zu Beginn der Pandemie als ein Kennzeichen von COVID-19 identifiziert. Mit dem Aufkommen besorgniserregender Varianten hat sich jedoch das durch die SARS-CoV-2-Infektion hervorgerufene klinische Profil verändert, wobei Anosmie seltener auftritt. Hier untersuchten wir die klinischen, olfaktorischen und neuroinflammatorischen Zustände von Goldhamstern, die mit dem ursprünglichen Wuhan-SARS-CoV-2-Stamm, seiner isogenen ORF7-Deletionsmutante und drei Varianten infiziert waren: Gamma, Delta und Omicron/BA.1. Wir zeigen, dass infizierte Tiere eine variantenabhängige klinische Erkrankung entwickeln, einschließlich Anosmie, und dass der ORF7 von SARS-CoV-2 zur Induktion einer Riechstörung beiträgt. Umgekehrt sind alle SARS-CoV-2-Varianten neuroinvasiv, unabhängig von der klinischen Erscheinung, die sie hervorrufen. Zusammengenommen bestätigt dies, dass Neuroinvasion und Anosmie unabhängige Phänomene bei einer SARS-CoV-2-Infektion sind. Mit neu erzeugtem Nanoluciferase-exprimierendem SARS-CoV-2 validieren wir den olfaktorischen Weg als wichtigen Eintrittspunkt in das Gehirn in vivo und zeigen in vitro, dass sich SARS-CoV-2 retrograd und anterograd entlang Axonen in mikrofluidischen Neuronen-Epithel-Netzwerken bewegt.

Die COVID-19-Pandemie bleibt ein großes globales Problem der öffentlichen Gesundheit. Seit Beginn der Pandemie im Dezember 2019 wurden mehr als 760 Millionen Fälle bestätigt, alle SARS-CoV-2-Varianten zusammengenommen1. Das ursprüngliche SARS-CoV-2 (Wuhan) führte im ersten Jahr der Pandemie zu verschiedenen besorgniserregenden Varianten (Alpha/B.1.1.7, Beta/B.1.351, Gamma/P.1), die wurden im Jahr 2020 fast vollständig durch das VoC Delta (B1.617.2, AY*), in den Jahren 2021–2022 durch das VoC Omicron und seine Abstammungslinien (z. B. BA.1, BA.2 und BA.5) und durch Rekombinanten (XBB*) ersetzt. 1.

SARS-CoV-2 infiziert Zellen der oberen und unteren Atemwege, und COVID-19 äußert sich durch eine Vielzahl respiratorischer und extrarespiratorischer Symptome, einschließlich neurologischer Manifestationen, die von Kopfschmerzen und Schwindel bis hin zu Anosmie, Ageusie und sogar Schlaganfall reichen2,3,4 . Derzeit geht man davon aus, dass die Neuropathologie von COVID-19 eine Folge von Entzündungen und Hypoxie ist und nicht eine direkte Virusinvasion in das ZNS5,6. Mit dem Aufkommen der VoCs und der steigenden Impf- oder Vorinfektionsrate hat sich jedoch die Symptomatik von COVID-19 verändert. In diesem Zusammenhang ist das durch das VoC Omicron/BA.1 hervorgerufene klinische Bild weniger schwerwiegend oder manchmal asymptomatisch, mit einer höheren Rate der Beteiligung der oberen Atemwege, wodurch die Riechschleimhaut geschont wird und folglich eine geringere Inzidenz von Anosmie auftritt, die ursprünglich als Kennzeichen von COVID galt -197,8,9,10,11,12,13.

Zuvor haben wir festgestellt, dass die durch SARS-CoV-2 Wuhan verursachte Infektion olfaktorischer sensorischer Neuronen und der Verlust von Flimmerhärchen in der Riechschleimhaut bei Menschen und Syrischen Hamstern mit einem Verlust des Geruchssinns sowie mit lokalen Entzündungen und Neuroinflammationen in den Riechkolben verbunden sind Dies bestätigt, dass der Goldhamster ein relevantes Modell zur Untersuchung der Pathogenese der SARS-CoV-2-Infektion ist14,15,16. Andere Autoren berichteten über eine anhaltende Mikrogliose in den Riechkolben infizierter Hamster17 und es wurden Unterschiede in der Neuroinvasivität und Neurovirulenz von VoCs beschrieben18. Darüber hinaus haben andere Autoren versucht, die Pathogenität von VoCs bei Hamstern zu vergleichen19,20,21, es fehlen jedoch Studien, die die Hirninvasion von SARS-CoV-2 mit neurologischen Symptomen in Verbindung bringen. Neben der Variation der Pathogenität aufgrund von Mutationen im Spike der Varianten könnten auch andere virale Proteine ​​eine Rolle bei Anosmie und lokaler Entzündung spielen, darunter ORF7, das nachweislich die angeborene Immunität des Wirts22,23,24 mit der Zelle beeinträchtigt Adhäsion in der Riechschleimhaut25 und mit Riechrezeptoren26.

Hier zeigen wir, dass SARS-CoV-2 Wuhan und die VoCs Gamma, Delta und Omicron/BA.1 alle in der Lage sind, in das Gehirn von Syrischen Hamstern einzudringen und eine gewebespezifische Entzündungsreaktion auszulösen. Mithilfe von durch umgekehrte Genetik erzeugten biolumineszierenden Viren zeigen wir, dass SARS-CoV-2 die Riechkolben infiziert, das klinische Profil, einschließlich der Riechleistung, hängt jedoch stark von der Variante ab. Darüber hinaus verringert die Deletion der ORF7ab-Sequenz im Vorfahrenvirus (Wuhan) die Häufigkeit von Geruchsverlusten, ohne das klinische Bild oder die Neuroinvasivität über die Riechkolben zu beeinträchtigen. Dementsprechend bestätigt diese Arbeit, dass SARS-CoV-2 sich innerhalb von Axonen und über den Riechweg als Haupteintrittsweg von SARS-CoV-2 in das Gehirn ausbreiten kann, und bestätigt das neurotrope Potenzial von SARS-CoV-2-Varianten. Neuroinvasion und Anosmie sind daher unabhängige Phänomene bei einer SARS-CoV-2-Infektion.

Wir untersuchten zunächst die Unterschiede im klinischen Bild, das durch verschiedene SARS-CoV-2-VoCs im Vergleich zum Vorfahrenvirus (Wuhan) hervorgerufen wird. Wir haben zunächst die In-vitro-Wachstumskurven dieser Viren in Vero-E6-Zellen getestet und keine signifikanten Unterschiede festgestellt (ergänzende Abbildung 1A). Anschließend wurden männliche Goldhamster intranasal mit 6 × 104 PFU von SARS-CoV-2 Wuhan oder den VoCs Gamma, Delta oder Omicron/BA.1 geimpft und vier Tage nach der Infektion (dpi) nachbeobachtet. Alle mit SARS-CoV-2 infizierten Tiere zeigten einen fortschreitenden Gewichtsverlust; Es wurde jedoch ein abweichender Effekt beobachtet (Kruskal-Wallis P < 0,0001, Abb. 1A, B), wobei mit SARS-CoV-2 Wuhan infizierte Tiere den stärksten mittleren Gewichtsverlust aufwiesen (15,8 %, Interquartilbereich „IQR“ 3,9 %). ), gefolgt von Gamma-infizierten Tieren (11,0 %, IQR 2,6 %), Delta-infizierten Tieren (9,4 %, IQR 3,1 %) und Omicron/BA.1-infizierten Tieren (1,9 %, IQR 2,5 %). Unspezifische krankheitsbedingte klinische Symptome (zerzaustes Fell, langsame Bewegung, Apathie) folgten dem gleichen Muster (Kruskal-Wallis P < 0,0001, Abb. 1D, E), wobei mit SARS-CoV-2 Wuhan infizierte Tiere die schlechteren klinischen Symptome aufwiesen Bild, gefolgt von Gamma- und Delta-infizierten Tieren, während Omicron/BA.1-infizierte Tiere eine verzögerte Manifestation leichter Symptome zeigten, die klinisch nur bei 4 dpi beobachtbar waren.

A, B Schwankung des Körpergewichts über vier Tage nach der Infektion. C Lungengewicht gemessen mit 4 dpi. D, E Klinischer Score über vier Tage nach der Infektion. Der klinische Score basiert auf einer kumulativen Skala von 0–4: zerzaustes Fell; langsame Bewegungen; Apathie; und das Fehlen von Explorationsaktivitäten. F Lungengewicht-zu-Körpergewicht-Verhältnis, gemessen bei 4 dpi. Die horizontalen Linien A–F geben den Medianwert und den Interquartilbereich an (n = 8/Gruppe). B, C, E, F Kruskal-Wallis-Test, gefolgt vom Dunn-Mehrfachvergleichstest (der angepasste p-Wert wird angezeigt, wenn er signifikant ist). G, H Riechleistung gemessen 3 Tage nach der Infektion (dpi). Der Geruchstest basiert auf dem Test zum Auffinden versteckter (vergrabener) Lebensmittel. Kurven stellen die Geruchsleistung der Tiere während des Tests dar (G) und Balken stellen die Endergebnisse dar (H) (n = 8/Gruppe). Chi-Quadrat-Test für Trend (der angepasste p-Wert wird angezeigt, wenn er signifikant ist). Siehe ergänzende Abbildungen. 1, 2.

Der Verlust des Geruchssinns ist ein typisches klinisches Zeichen von mit SARS-CoV-2 infizierten Wuhan-Hamstern14, das Geruchsdefizit unterschied sich jedoch je nach den verschiedenen VoCs (Chi-Quadrat für Trend P < 0,0001): 62,5 % (5/8) der SARS-CoV-2- 2 Wuhan-infizierte Tiere zeigten einen Verlust des Geruchssinns (Log-Rank-Test im Vergleich zum Schein-P = 0,0012), nur 12,5 % (1/8) der Gamma-infizierten Tiere verloren den Geruchssinn vollständig, wobei 62,5 % (5/8) eine Beeinträchtigung aufwiesen Geruchsleistung (d. h. längere Zeit zum Auffinden der versteckten Getreidesorten) (Log-Rank-Test im Vergleich zum Schein-P < 0,0001). Im Gegensatz dazu zeigte keines der mit Delta und Omicron/BA.1 infizierten Tiere Anzeichen einer Geruchsbeeinträchtigung (Abb. 1G, H). Alle Tiere fanden während des Kontrolltests das sichtbare Futter. Dies zeigt, dass kein Krankheitsverhalten, keine Sehbehinderung oder kein Bewegungsdefizit für die Verzögerung beim Auffinden des versteckten Futters verantwortlich war.

Mehrere Mutationen auf dem Spike unterscheiden die verschiedenen VoCs. Darüber hinaus weisen einige VoC-Isolate auch Deletionen in der ORF7-Sequenz auf27,28,29,30, einschließlich des in der vorliegenden Studie verwendeten Delta-Isolats (Deletion über die Positionen 27506 bis 27540 des Referenzgenoms von SARS-CoV-2 Wuhan, was einen Stopp erzeugt). Codon; ergänzende Abb. 1D). Da ein möglicher Zusammenhang zwischen ORF7b und Geruchsverlust vorgeschlagen wurde25, konstruierten wir ein rekombinantes SARS-CoV-2 basierend auf dem CoV-2/W-Rückgrat, wobei die ORF7ab-Sequenz durch die von GFP ersetzt wurde (SARS-CoV-2 Wuhan/ ΔORF7ab) (Ergänzende Abbildung 4A). Bemerkenswerterweise ähnelte das klinische Profil der mit Wuhan/ΔORF7ab infizierten Hamster dem des Wuhan-Wildtyp-SARS-CoV-2 (Abb. 1A–F), was zeigt, dass ORF7ab für die Virusinfektion und -replikation nicht essentiell ist. Die Häufigkeit von Geruchsverlusten ging jedoch deutlich zurück; Nur 25 % (2/8) der infizierten Tiere zeigten Anzeichen von Anosmie, im Gegensatz zu 62,5 % (5/8), die bei mit CoV-2/SARS-COV-2 infizierten Wuhan-Hamstern beobachtet wurden (Abb. 1G, H). . Trotz dieser Verringerung der Anosmie-Inzidenz wurde Wuhan/ΔORF7ab immer noch in den Atemwegen und im Riechkolben infizierter Tiere nachgewiesen, mit sogar noch höheren Titern (Abb. 2A, B).

A Infektiöse Virustiter in der Lunge, den Nasenmuscheln und den Riechkolben 4 Tage nach der Infektion (dpi), ausgedrückt als TCID50 pro 100 mg Gewebe. Horizontale Linien zeigen den Median und den Interquartilbereich an (n = 4/Gruppe). B SARS-CoV-2-Virus-RNA-Last in der Lunge, den Nasenmuscheln und den Riechkolben bei 4 dpi nachgewiesen. Genomische und subgenomische virale RNA wurden anhand der E-Gensequenz bewertet. Horizontale Linien zeigen den Medianwert und den Interquartilbereich an. Graue Linien verbinden Symbole derselben Tiere (n = 4/Gruppe). Genexpressionswerte in der Lunge (C), Nasenmuscheln (D) und Riechkolben (E) von Mx2, Ifn-β, Il-6, Cxcl10, Tnf-α und Il-10 bei 4 dpi. Die horizontalen Linien A–E geben den Medianwert und den Interquartilbereich an (n = 4/Gruppe). Kruskal-Wallis-Test, gefolgt vom Mehrfachvergleichstest nach Dunn (der angepasste p-Wert wird angezeigt, wenn er signifikant ist). nd: nicht erkannt. Siehe ergänzende Abbildungen. 1, 2.

In Bezug auf die Lungenpathologie waren wie bei den anderen klinischen Parametern die Lungenvergrößerung und das Lungengewicht-zu-Körpergewicht-Verhältnis (LW/BW) bei SARS-COV-2-Wuhan- und Wuhan/ΔORF7ab-infizierten Tieren signifikant höher; Gamma- und Delta-infizierte Tiere wiesen mittlere Werte auf, wohingegen die Werte von Omicron/BA.1-infizierten Tieren denen von scheininfizierten Tieren nahe kamen (Kruskal-Wallis P < 0,0001, Abb. 1C, F). Ebenso folgten die histopathologischen Befunde in der Lunge der gleichen Tendenz: Bei allen infizierten Tieren wurden Stauung, Ödeme, Infiltration mononukleärer Zellen, Verdickung der Alveolarwände und Abschuppung des bronchiolären Epithels beobachtet (ergänzende Abbildung 2A), zusammen mit einem diffusen SARS-CoV -2-Nukleokapsid-Färbung (ergänzende Abbildung 2B), wobei in der Lunge von mit SARS-COV-2 Wuhan infizierten Tieren schwerwiegendere Veränderungen beobachtet wurden als bei mit Gamma, Delta und Omicron/BA.1 infizierten Hamstern.

In einer multivariaten Analyse klinischer Parameter, die bei 4 dpi aufgezeichnet wurden, erklärten die beiden ersten Hauptkomponenten 91,9 % der Probenvariabilität. Das Körpergewicht wirkte sich negativ auf PC1 (Hauptkomponente) aus und korrelierte negativ mit dem klinischen Score und dem LW/BW-Verhältnis, wohingegen sich die Geruchsleistung positiv auf PC2 auswirkte (ergänzende Abbildung 3A). Im Diagramm der Hauptkomponentenanalyse (PCA) bezüglich gewebebedingter Entzündungen war der Unterschied zwischen den Gruppen deutlich: Schein- und Omicron/BA.1-infizierte Tiere wurden homogen und relativ dicht beladen, gefolgt von den Delta-infizierten Tieren. SARS-COV-2-Wuhan-, Wuhan/ΔORF7ab- und Gamma-infizierte Tiere wurden auf verteiltere Weise belastet, weit entfernt von den anderen VoCs, Auswirkung des olfaktorischen Leistungsdefizits und des klinischen Schweregrads (ergänzende Abbildung 3C).

Als nächstes haben wir den Virustiter und die RNA-Last in den oberen Atemwegen (Nasenmuscheln) und in den unteren Atemwegen (Lunge) gemessen. In den Nasenmuscheln und in der Lunge aller infizierten Hamster wurden unabhängig vom VoC infektiöse Viren nachgewiesen. Es wurde jedoch ein Varianteneffekt beobachtet, mit den höchsten Werten für die Gamma-infizierten Tiere und den niedrigsten Werten für Omicron/BA. 1-infizierte Tiere (Kruskal-Wallis P < 0,0001, Abb. 2A). Genomische und subgenomische SARS-CoV-2-RNA wurde gleichermaßen in der Lunge aller infizierten Tiere nachgewiesen; Anders jedoch in den Nasenmuscheln, unabhängig von der Positivität aller Proben, zeigten Delta-infizierte Tiere die höchste Viruslast (Kruskal-Wallis P = 0,0023, Abb. 2B).

Sowohl die oberen als auch die unteren Atemwege reagierten auf die Infektion mit allen VoCs (Abb. 2C, D), jedoch mit einer gewebespezifischen Entzündungssignatur: In der Lunge waren Mx2, Il-6, Cxcl10 und Il-10 für alle VoCs hochreguliert und am höchsten bei SARS-COV-2 Wuhan-infizierten Tieren (Abb. 2C). In den Nasenmuscheln zeigte die Genexpression von Ifn-β und Il-6 die höchsten Werte bei mit SARS-COV-2 Wuhan infizierten Tieren und die niedrigsten bei mit Omicron/BA.1 infizierten Tieren. Die Mx2-, Cxcl10- und Il-10-Expression war bei Delta-infizierten Tieren am höchsten, während Omicron/BA.1-infizierte Tiere die niedrigsten Werte aufwiesen (Abb. 2D). Interessanterweise induzierte die Wuhan/ΔORF7ab-Infektion im Vergleich zu Wuhan oder den anderen VoCs eine andere Lungenentzündungssignatur, dargestellt durch eine höhere Expression von Mx2 und Ifn-β (Abb. 2C). In den Nasenmuscheln induzierte die Wuhan/ΔORF7ab-Infektion auch eine höhere Expression von Mx2, aber auch Il-6, Cxcl10, Tnf-α und Il-10 (Abb. 2D). Um die gewebe- und virusbedingte Genexpression besser einschätzen zu können, führten wir eine multivariate Analyse dieser Daten durch. Interessanterweise erklärten die beiden ersten Hauptkomponenten 79, 5% der Stichprobenvariabilität (ergänzende Abbildung 3B). In den PCA-Diagrammen wurden die Nasenmuscheln aller infizierten Hamster nahe beieinander belastet (ergänzende Abbildung 3D), wohingegen die Lungen durch einen wichtigen Effekt von Il-6, Cxcl10 und Il-10 getrennt waren (ergänzende Abbildung 3D). ).

Nachdem wir das klinische und entzündliche Profil der infizierten Tiere ermittelt hatten, wollten wir die Auswirkung der Infektion auf die Riechkolben beurteilen. Bemerkenswerterweise wurden, auch wenn die Geruchsleistung je nach VoC unterschiedlich war (Abb. 1G, H), positive Virustiter in den Riechkolben von Tieren aller infizierten Gruppen festgestellt, wobei Wuhan/ΔORF7ab- und Gamma-infizierte Tiere den höchsten Titer aufwiesen 4 dpi (Kruskal-Wallis P = 0,0096, Abb. 2A). Diese Ergebnisse wurden auch durch den Nachweis genomischer viraler RNA in den Riechkolben von Tieren aller infizierten Gruppen bestätigt, allerdings war die virale RNA-Belastung bei mit SARS-COV-2 Wuhan infizierten Tieren höher (Kruskal-Wallis P = 0,0104, Abb. 2B). Umgekehrt lag in diesen Proben die subgenomische RNA unterhalb der Nachweisgrenze.

Die Riechkolben zeigten ein interessantes Entzündungsprofil. Das antivirale Mx2-Gen war zusammen mit den Entzündungsgenen Ifn-β, Il-6 und Cxcl10 in den Riechkolben aller infizierten Hamster stark hochreguliert (Abb. 2E), unabhängig von ihrer Geruchsleistung im Nahrungsfindungstest (Abb. 1G, H), dennoch war die Il-10-Expression in den Riechkolben von mit SARS-COV-2 Wuhan/ΔORF7ab infizierten Tieren stark hochreguliert (im Vergleich zum Schein). Unerwarteterweise war die Genexpression dieser ausgewählten Ziele in den Riechkolben von Delta-infizierten Tieren tendenziell höher (Abb. 2E). In einer multivariaten Analyse der gewebe- und virusbezogenen Genexpression neigten die Riechkolben von mit SARS-COV-2 Wuhan infizierten Tieren dazu, sich in der Nähe der entsprechenden Nasenmuscheln zu laden (Wirkung von Il-6, Cxcl10 und Il-10). , wohingegen Riechkolben von Gamma-, Delta- und Omicron/BA.1-infizierten Tieren separat geladen wurden, was möglicherweise den Einfluss der unterschiedlichen Expression von Mx2, Tnf-α und Ifn-β widerspiegelt (ergänzende Abbildung 3D).

Nachdem wir das Virus mithilfe virologischer und molekularer Techniken im Riechkolben nachgewiesen hatten, wollten wir die Infektion sichtbar machen. Wir untersuchten die Wuhan-Verteilung von SARS-CoV-2 im gesamten Gehirn, indem wir die Gewebereinigung des gesamten Kopfes mit der Lichtblattmikroskopie-Bildgebung mit iDISCO+31 kombinierten. Bei 4 dpi zeigten alle Wuhan-infizierten Hamster eine diffuse Virusverteilung in der Nasenhöhle: Nasenmuscheln und Riechepithel (Abb. 3A und Zusatzfilm 1). In diesem Sinne präsentierten alle mit SARS-COV-2 infizierten Wuhan-Tiere SARS-CoV-2 in den Riechkolben in spärlichen Neuronen, die in der Nähe des Riechnerveneintrittspunkts lokalisiert waren (Abb. 3B und Zusatzfilm 1). Mit dieser Technik wurden keine infizierten Zellen in anderen Bereichen des Gehirns beobachtet und es wurden keine Veränderungen im Gefäßnetzwerk festgestellt.

A, B iDISCO+ Ganzkopfreinigung und Immunmarkierung gegen das SARS-CoV-2-Nukleokapsid bei Hamstern, die mit dem ursprünglichen SARS-CoV-2-Virus (Wuhan) infiziert sind, 4 Tage nach der Infektion (dpi). Eine repräsentative Nasenmuschel (Sagittalschnitt vom Schädel) mit einer diffusen Verteilung von SARS-CoV-2 (Maßstabsbalken = 500 µm). B Repräsentativer Riechkolbenabschnitt, gefärbt auf SARS-CoV-2-Nukleokapsid und Podoplanin (CD31/Podo), um das Gefäßkompartiment zu identifizieren. Beachten Sie das Vorhandensein von SARS-CoV-2 in den Neuronen des Riechkolbens, ohne dass es makroskopische Veränderungen im Gefäßnetzwerk des Riechkolbens gibt. Maßstabsleiste: 200 µm. Siehe Zusatzfilm 1. C, F Biolumineszierende rekombinante SARS-CoV-2-Viren lösen eine klinische Erkrankung mit Infektion der Riechkolben aus. C Klinisches Profil von Hamstern, die mit den rekombinanten Viren SARS-CoV-2 Wuhan_nLuc und Wuhan/ΔORF7ab_nLuc (basierend auf dem ursprünglichen SARS-CoV-2 Wuhan) und Delta_nLuc (basierend auf der Delta-Variante) infiziert sind. Der Körpergewichtsverlust und der klinische Score sind vergleichbar mit denen, die durch Wildtypviren hervorgerufen werden (n = 4/Gruppe). Horizontale Linien zeigen den Median und den Interquartilbereich an (siehe Abb. 1A). Der klinische Score basiert auf einer kumulativen Skala von 0–4: zerzaustes Fell; langsame Bewegungen; Apathie; und das Fehlen von Explorationsaktivitäten (siehe Abb. 1D). D Ex-vivo-Biolumineszenzwerte der Lunge, des Riechkolbens (ventrale Ansicht) und des Gehirns (ventrale Ansicht) bei 4 dpi (n = 4/Gruppe). Horizontale Linien zeigen den Medianwert und den Interquartilbereich an. Kruskal-Wallis-Test, gefolgt vom Mehrfachvergleichstest nach Dunn (der angepasste p-Wert wird angezeigt, wenn er signifikant ist). Der grau schraffierte Bereich entspricht Hintergrundsignalen, die von denselben Geweben eines scheininfizierten Hamsters erhalten wurden. E, F Repräsentative Ex-vivo-Bildgebung einer Lunge (C) und eines Gehirns (D) eines Hamsters, der mit einem rekombinanten SARS-CoV-2 infiziert ist, das nLuc bei 4 dpi exprimiert. Beachten Sie, dass im Gehirn der größte Biolumineszenzfokus in der ventralen Fläche der Riechkolben lokalisiert ist. Siehe ergänzende Abbildung 3.

Als nächstes verwendeten wir eine ergänzende Methode, um die Infektion der Riechkolben sichtbar zu machen. Zu diesem Zweck haben wir rekombinante Viren generiert, die die Nanoluciferase durch umgekehrte Genetik exprimieren (Wuhan_nLuc, Wuhan/ΔORF7ab_nLuc und Delta_nLuc; ergänzende Abbildung 1B, C und ergänzende Abbildung 4A). Das durch diese drei neuen rekombinanten Viren induzierte Krankheitsprofil ähnelte dem durch die Wildtyp-Elternviren induzierten Profil (Abb. 3C). Die In-vivo-Bildgebung infizierter Hamster wurde bei 4 dpi unter Verwendung von Fluorfurimazin (FFz) als Substrat durchgeführt. Im Bereich der Nasenhöhle wurden sehr geringe positive Signale beobachtet, möglicherweise aufgrund der Dicke der Haut und der Knochen, die die Lichtemission blockieren könnten, aber deutlich höher im Wuhan_nLuc als im Wuhan/ΔORF7ab_nLuc Delta_nLuc (Kruskal-Wallis P = 0,0107). , Ergänzende Abb. 4BC). Bei der Ex-vivo-Bildgebung wurden empfindlichere Ergebnisse erzielt. Nach der Euthanasie wurden die Lungen und das Gehirn entnommen und fotografiert. Positive Signale in der Lunge wurden für die drei Viren mit der gleichen Intensität erhalten (Abb. 3D) und zeigten eine multifokale/diffuse Verteilung (Abb. 3E und ergänzende Abb. 4D). Die Gehirne wurden in ventraler Position abgebildet, um die Riechkolben besser freizulegen. Aus den Gehirnen von Hamstern, die mit allen Viren infiziert waren, wurden intensive Lumineszenzsignale aufgezeichnet; Wenn der ROI (Region of Interest) ausschließlich in den Riechkolben platziert wurde, war die Intensität in Wuhan_nLuc höher als in Delta_nLuc; Im Gegensatz dazu war die Intensität bei Delta_nLuc höher, wenn man den gesamten ventralen Bereich des Gehirns betrachtete. Wuhan/ΔORF7ab_nLuc induzierte Zwischenwerte (Abb. 3C und ergänzende Abb. 4D), die möglicherweise die höhere Replikationsrate widerspiegeln, die in den mit Wuhan infizierten Riechkolben festgestellt wurde (Abb. 2B). Trotz Intensitätsunterschieden waren die Riechkolben die am häufigsten infizierte Struktur im Gehirn, und sagittale Ansichten des Gehirns deuten darauf hin, dass der Ursprung des Lumineszenzsignals der ventrale Teil der Riechkolben ist, der sich oberhalb des Riechepithels in der Nasenhöhle befindet (Abb. 3E und ergänzende Abb. 4E).

Es wurde festgestellt, dass alle getesteten SARS-CoV-2-Varianten in der Lage sind, in das Zentralnervensystem einzudringen und die Riechkolben zu infizieren, die Häufigkeit von Riechstörungen variierte jedoch je nach VoC, wobei mit Delta und Omicron/BA.1 infizierte Hamster keine Anzeichen davon zeigten Anosmie (Abb. 1G, H). Um zu testen, ob das virale Inokulum die Neuroinvasivität von SARS-CoV-2 und das Auftreten von Geruchsstörungen beeinflussen könnte, infizierten wir Hamster mit einer um 2 Logarithmen niedrigeren Infektionsdosis von Wuhan (6 × 102 PFU). Diese Tiere wurden denselben oben beschriebenen klinischen Verhaltenstests unterzogen. In der akuten Phase der Infektion, bis zu 4 dpi, führte die niedrige Infektionsdosis zu einem ähnlichen Körpergewichtsverlust und einem ähnlichen klinischen Ergebnis wie bei den mit dem anfänglichen Inokulum (6 × 10^4 PFU) infizierten Tieren sowie zu infektiösen Virustitern in den Tieren Atemwege und in den Riechkolben (Ergänzende Abb. 5). Überraschenderweise zeigten Tiere, die mit einer niedrigeren Infektionsdosis infiziert waren, trotz des Vorhandenseins infektiöser Viren in den Riechkolben eine geringere Inzidenz von Riechstörungen (25 %, 2/8).

In vitro ist die Infektion von Neuronen mit SARS-CoV-2 ein widersprüchliches Thema32. Einerseits gibt es Beschreibungen, dass SARS-CoV-2 hPSC-abgeleitete dopaminerge Neuronen infizieren und neuronale Seneszenz verursachen kann33, oder dass eine kleine Untergruppe von iPSC-abgeleiteten Neuronen einer abortiven Infektion ausgesetzt sein kann34. Andererseits wurde vermutet, dass das Vorhandensein zusätzlicher permissiver Zellen für eine erfolgreiche neuronale Infektion notwendig sein könnte35. Die von uns unternommenen Versuche, Monokulturen von hNSC-abgeleiteten Neuronen zu infizieren, waren nicht positiv, und daher entwickelten wir ein Co-Kultursystem mit hNSC-abgeleiteten Neuronen und SARS-CoV-2-rezeptiven Epithelzellen (A549-hACE2-TMPRSS2-Zellen). Wir haben diese Co-Kulturen mithilfe von Axondioden in Mikrofluidikgeräten36 gezüchtet, um die Fähigkeit von SARS-CoV-2 zu beurteilen, Neuronen zu infizieren und sich innerhalb von Axonen zu bewegen. In diesen Geräten bilden die Kokulturen Neuronen-Epithel-Netzwerke sowohl in der linken als auch in der rechten Kammer des Geräts (Abb. 4A, B), die ausschließlich über ein unidirektionales Wachstum von Axonen von der linken zur rechten Kammer verbunden sind ( Abb. 4C). Anschließend wurde die rechte oder linke Kammer der Mikrofluidikgeräte mit dem Ahnenvirus (Wuhan), dem Wuhan/ΔORF7ab und den VoCs Gamma, Delta und Omicron/BA.1 infiziert. Bei 3 dpi wurden infizierte Zellen sowohl in der rechten als auch in der linken Kammer aller Geräte nachgewiesen, was bestätigt, dass das Virus innerhalb der Axone von der rechten in die linke Kammer wanderte (retrograder axonaler Transport; Abb. 4D, H und ergänzende Abb. 6). ) und von der linken zur rechten Kammer innerhalb der Axone (anterograder axonaler Transport; Abb. 4I – M und ergänzende Abb. 7). Um die Beteiligung des axonalen Transports von SARS-CoV-2 weiter zu bestätigen, verwendeten wir Ciliobrevin D, einen Inhibitor der zytoplasmatischen Dynein-Transportmaschinerie, der auf den bidirektionalen Transport von Organellen entlang von Axonen einwirkt37. Als die Infektion in Gegenwart von Ciliobrevin D auftrat, wurde der retrograde Transport blockiert und in der linken Kammer wurden keine mit SARS-CoV-2 infizierten Zellen beobachtet (ergänzende Abbildung 8). Um die Ankunft viraler Partikel über die Axone zu quantifizieren, infizierten wir mikrofluidische Geräte sowohl unter retrograden als auch anterograden Bedingungen mit den rekombinanten Viren, die die Nanoluziferase Wuhan_nLuc, Wuhan/ΔORF7ab_nLuc und Delta_nLuc exprimieren, und maßen täglich die Lumineszenz in den Überständen (Supplementary). Abb. 9). In den Überständen aller Aufnahmekammern ab 1 dpi wurde eine positive nLuc-Aktivität festgestellt, die mit der Zeit zunehmend zunahm (ergänzende Abbildung 9G, H), was auf eine retrograde und anterograde SARS-CoV-2-Bewegung hinweist. Die Lumineszenzwerte in den infizierten Kammern waren konstant und lagen an der maximalen Nachweisgrenze (Ergänzende Abbildung 1).

Eine schematische Ansicht einer Axondiode in einem mikrofluidischen Gerät, das Neuronen und Epithelzellen in der linken und rechten Kammer enthält. Die Kammern sind ausschließlich durch die Axone von Neuronen verbunden, deren Zellkörper sich in der linken Kammer befinden. In dieser Studie wurde SARS-CoV-2 in der rechten Kammer (zur Beurteilung des retrograden axonalen Transports) oder in der linken Kammer (zur Beurteilung des anterograden axonalen Transports) hinzugefügt. B Hellfeldansicht eines Neuronen-Epithel-Netzwerks, das die Kokultur von Neuronen und A549-ACE2-TMPRSS2 in beiden Kammern zeigt, getrennt durch trichterförmige Mikrokanäle (Maßstabsbalken = 200 µm). C Detail der β-Tubulin III-positiven Axone, die die trichterförmigen Mikrokanäle durchqueren und in die rechte Kammer gelangen (Maßstabsbalken = 50 µm). Neuronen-Epithel-Netzwerke, die in der rechten Kammer mit SARS-CoV-2 Wuhan (D), Wuhan/ΔORF7ab (E), Gamma (F), Delta (G) und Omicron/BA.1 (H) infiziert sind, zeigen infizierte Zellen in der linke Kammern (Maßstabsbalken = 50 µm). Neuronen-Epithel-Netzwerke, die in der linken Kammer mit SARS-CoV-2 Wuhan (I), Wuhan/ΔORF7ab (J), Gamma (K), Delta (L) und Omicron/BA.1 (M) infiziert sind, zeigen infizierte Zellen in die rechten Kammern (Maßstabsbalken = 50 µm). Hoechst: Kerne (blau). TUBB3: β-Tubulin III (rot). N: SARS-CoV-2-Nukleokapsid (grün). Die schwarz-weiß gestreiften Zonen rechts (D–H) und links (I–M) der Mikrofotografien stellen die Mikrokanäle dar, die während der Immunfärbung nicht zugänglich sind. B–M Diese Mikrofotografien sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Siehe ergänzende Abbildungen. 6-9. Panel A wurde mit BioRender.com erstellt.

Der Neurotropismus von SARS-CoV-2 ist immer noch umstritten32. Während Studien zu natürlichen Infektionen beim Menschen und experimentellen Infektionen in Tiermodellen über eine Gehirninfektion durch SARS-CoV-214,38,39,40,41,42 berichteten, auch in In-vitro-Infektionsmodellen beim Menschen43,44,45, gelang es anderen nicht, sie zu erkennen SARS-CoV-2 im Nervengewebe5,46. Diese Inkonsistenz kann auf den Zeitpunkt der Infektion zurückzuführen sein, da die verfügbaren Proben in den meisten Fällen postmortal sind und wir im Hamstermodell gezeigt haben, dass die Virusisolierung zeitabhängig ist, wobei in akuten Phasen höhere Viruslasten festgestellt werden. Punkte14. Trotz dieser offenen Frage sind die Auswirkungen einer SARS-CoV-2-Infektion auf das Gehirn unbestreitbar2,47,48,49. Die meisten dieser veröffentlichten Daten beziehen sich auf das ursprüngliche SARS-CoV-2 (Wuhan), es liegen jedoch weniger Informationen zur Neuropathogenese von VoCs vor10. Hier zeigen wir, dass alle untersuchten SARS-CoV-2-Viren (Wuhan, Gamma, Delta und Omicron/BA.1), einschließlich neu generierter rekombinanter SARS-CoV-2, in der Lage sind, in das Gehirn einzudringen, höchstwahrscheinlich über die Riechnerven. und Entzündungen im Nervengewebe zu fördern.

Trotz dieser gemeinsamen Neuroinvasivität über die Riechkolben hängen das Krankheitsprofil und die Reaktionen der Atemwege stark von der SARS-CoV-2-Variante ab. Tatsächlich zeigen wir anders als in anderen Berichten19,50, dass alle VoCs Goldhamster infizieren und Lungenentzündungen fördern können, einschließlich Omicron/BA.1, wahrscheinlich aufgrund infektiöser Dosen oder viraler Isolate. Ein „Varianteneffekt“ im klinischen Erscheinungsbild und in der gewebebedingten Entzündung war offensichtlich, wobei der Schweregrad der Erkrankung die folgende Reihenfolge aufwies: SARS-CoV-2 Wuhan > Gamma > Delta > OmicronBA.1, was die Hypothese stützt, dass Omicron/ Die Evolution von BA.1 hat zu einem Tropismus geführt, der stärker auf die oberen Atemwege beschränkt ist, wodurch eine weniger schwere klinische Erkrankung verursacht wurde10,51,52,53. Obwohl mit unterschiedlichem Schweregrad, scheinen Neuroinvasiveität, Neurotropismus und Neurovirulenz32 konservierte Merkmale bei SARS-CoV-2-Varianten zu sein. Tatsächlich unterstützen die hier präsentierten Daten die neuroinvasive Fähigkeit von SARS-CoV-2, da wir neben dem Nachweis viraler RNA und der Isolierung infektiöser Viren aus den Riechkolben auch deutlich SARS-CoV-2-infizierte Neuronen im Gehirn von SARS-CoV-2 beobachten konnten Hamster durch Lichtblattmikroskopie. Dennoch beschränkte sich der Nachweis von SARS-CoV-2-infizierten Zellen bei Hamstern im Gegensatz zu dem, was bei K18-hACE2-Mäusen berichtet wurde, deren ACE2-Expressionsmuster nicht physiologisch und ektopisch ist39, auf die Riechkolben, ohne dass es Hinweise auf eine Umgestaltung der Gehirngefäße oder Viren gab mit Blutgefäßen verbunden.

Daher ist eine Riechkolbeninfektion unabhängig von der betrachteten Variante ein häufiges Merkmal des SARS-CoV-2-Infektionsprozesses. Auch in diesem Gewebe wurde eine Entzündungsreaktion mit einer häufigen Hochregulierung des antiviralen Gens Mx2 beobachtet, unabhängig vom VoC. Der Grund, warum einige VoCs keinen Geruchsverlust verursachen, ist immer noch eine offene Frage. Die Infektion und Entzündung der Riechkolben scheint, wenn sie an einer SARS-CoV-2-assoziierten Anosmie beteiligt ist, nicht auszureichen, um beim Goldhamster einen Geruchsverlust zu verursachen. Aggressionen gegen die Riechschleimhaut und nicht gegen den Riechkolben sind in der Tat wahrscheinlich die Hauptfaktoren, die zur Anosmie beitragen, da die Erholung von der Anosmie mit der Regeneration des Riechepithels bei Hamstern in Zusammenhang steht54,55. Darüber hinaus könnten signifikante Veränderungen im Riechepithel, wie Apoptose, architektonische Schäden, Entzündungen, Herunterregulierung von Geruchsrezeptoren und funktionelle Veränderungen in Riechsinnesneuronen, zusätzlich zur Infektion an sich auch zum Auftreten von Anosmie beitragen10,14, 56,57,58,59. Daher scheint es, dass eine Kombination aus einer Infektion und einer Entzündung der Riechschleimhaut erforderlich ist, um eine Anosmie auszulösen. Die geringere Inzidenz von Anosmie, die nach einer Infektion durch einige VoCs beobachtet wird, ist daher mit geringeren Entzündungsniveaus verbunden.

Darüber hinaus können neben Mutationen in der Spike-Sequenz im Genom der SARS-CoV-2-Varianten weitere Mutationen in anderen Regionen des viralen Genoms vorhanden sein, einschließlich Deletionen in den ORF7a- und ORF7b-Sequenzen27,28,29,30. ORF7a und ORF7b wurden mit virusinduzierter Apoptose und einer Beeinträchtigung der angeborenen Immunität und der antiviralen Reaktion in Verbindung gebracht22,23,24,60,61, ohne jedoch für die Virusinfektion und -replikation wesentlich zu sein62,63. Darüber hinaus hat ORF7b das Potenzial, Zelladhäsionsproteine ​​in der Riechschleimhaut zu stören25, und interessanterweise wurde auch über eine binäre Wechselwirkung zwischen ORF7b und dem menschlichen Riechrezeptor OR1D5 berichtet26. Deletionen oder Mutationen in diesen Regionen können daher eine zusätzliche Rolle bei der Auslösung von Geruchsstörungen spielen, indem sie die Architektur und Strukturen des Riechepithels bewahren. Ein weiterer wichtiger Punkt ist, dass wir ein ähnliches klinisches Profil und eine geringe Inzidenz von Geruchsstörungen wie bei SARS-CoV-2 Wuhan/ΔORF7ab beobachten können, indem wir einfach das virale Inokulum von SARS-CoV-2 Wuhan reduzieren. Unabhängig von einer vergleichenden Entwicklung des Körpergewichtsverlusts und des klinischen Scores64 kam Anosmie bei Tieren, die mit einer niedrigen Dosis von SARS-CoV-2 Wuhan infiziert waren, seltener vor. Dies hängt möglicherweise mit der geringeren anfänglichen Aggression zusammen, die das Riechepithel aufgrund niedrigerer infektiöser Dosen erleidet55,65 und könnte auch erklären, warum in anderen Studien keine Geruchsstörung festgestellt wurde, obwohl entzündliche Veränderungen im Gehirn festgestellt wurden66.

Unabhängig davon, ob eine Anosmie auftritt oder nicht, kann SARS-CoV-2 olfaktorische sensorische Neuronen und den Riechkolben infizieren10,14, und wir zeigen hier, dass das Virus Neuronen infizieren und sich innerhalb der Axone sowohl in retrograder als auch anterograder Richtung ausbreiten kann. Es wurde angenommen, dass die SARS-CoV-2-Neuroinvasion durch axonalen Transport über Hirnnerven (olfaktorisch, vagus, trigeminus) oder über den hämatogenen Weg erfolgt32,67,68. Die hier präsentierten Daten unterstützen nicht die hämatogene Diffusion von SARS-CoV-2 in Richtung Gehirn, bestätigen jedoch die Hypothese, dass der Riechweg ein bevorzugtes Eintrittsportal in Richtung der Riechkolben ist69. Eine Gehirninfektion über den Riechweg scheint daher ein gemeinsames Merkmal von Coronaviren70,71 zu sein, unabhängig vom klinischen Krankheitsbild. Abschließend unterstreicht diese Studie, dass Neuroinvasion und Anosmie daher unabhängige Phänomene bei einer SARS-CoV-2-Infektion sind.

Alle Tierversuche wurden gemäß der französischen Gesetzgebung und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Rates der Europäischen Gemeinschaften (2010/63/UE, französisches Gesetz 2013–118, 6. Februar 2013) sowie gemäß den Vorschriften der Tierpflegeausschüsse des Institut Pasteur durchgeführt. Die Ethikkommission für Tierversuche (CETEA 89) des Institut Pasteur genehmigte diese Studie (200023; APAFIS#25326-2020050617114340 v2), bevor mit den Experimenten begonnen wurde. Hamster wurden in Gruppen zu je vier Tieren in Isolatoren gehalten und in Sicherheitsschränken der Klasse III in den Tieranlagen des Pasteur-Instituts manipuliert, die vom französischen Landwirtschaftsministerium für die Durchführung von Experimenten an lebenden Nagetieren akkreditiert waren. Alle Tiere wurden in strikter Übereinstimmung mit der guten Tierpraxis behandelt.

Das Isolat BetaCoV/France/IDF00372/2020 (EVAg-Sammlung, Ref-SKU: 014V-03890) wurde freundlicherweise vom Nationalen Referenzzentrum für Atemwegsviren zur Verfügung gestellt, das vom Institut Pasteur (Paris, Frankreich) betrieben und von Pr. geleitet wird. Sylvie van der Werf. Die menschliche Probe des Stammes hCoV-19/Japan/TY7-501/2021 (brasilianische Variante, JPN [P.1]) wurde vom japanischen Nationalen Institut für Infektionskrankheiten (Tokio, Japan) bereitgestellt. Das Isolat SARS-CoV-2 Delta/2021/I7.2 200 (indische Variante, GISAID-ID: EPI_ISL_2029113) und das Isolat SARS-CoV-2 Omicron/B.1.1.529 (Omicron BA.1-Variante, GISAID-ID: EPI_ISL_6794907). ) wurden freundlicherweise von der Virus- und Immunitätsabteilung des Institut Pasteur unter der Leitung von Olivier Schwartz zur Verfügung gestellt72,73. Virusbestände wurden auf infizierten Vero-E6-Zellen mit einer Infektionsmultiplizität von 1 × 10–4 PFU/Zelle hergestellt. Das Virus wurde 3 Tage nach der Infektion geerntet, geklärt und dann vor der Lagerung bei –80 °C aliquotiert. Virusbestände wurden auf Vero-E6-Zellen durch klassische Plaque-Assays unter Verwendung halbfester Überzüge (Avicel, RC581-NFDR080I, DuPont)74 titriert.

Rekombinante Viren, die Nanoluciferase (nLuc) als Reportergen exprimieren, wurden durch umgekehrte Genetik erhalten. Wuhan_nLuc wurde vom Klon synSARS-CoV-2-GFP-P2A-ORF7a (Klon Nr. 41) abgeleitet, der wie beschrieben erzeugt wurde75,76,77,78,79, wobei das GFP-Reportergen durch das nLuc-Gen ersetzt wurde. Die Klonierungsstrategie wurde optimiert, um eine vollständige cDNA des Delta_nLuc-Virus auf demselben Grundgerüst wie das Isolat EPI_ISL_2029113 aufzubauen. SARS-CoV-2 Wuhan/ΔORF7ab wurde unter Verwendung desselben umgekehrten genetischen Systems erhalten, indem die vollständige ORF7ab-Sequenz durch die von GFP oder durch nLuc (Wuhan/ΔORF7ab_nLuc) ersetzt wurde.

Das virale Genom wurde in 11 überlappende Fragmente von jeweils etwa 3 kb aufgeteilt. Diese Fragmente und zwei Fragmente, die für verschiedene hefespezifische Selektionsgene (His3 und Leu2) kodieren, wurden im Hefe-Zentromer-Plasmid pRS416 rekombiniert, um den vollständigen Genomklon des rekombinanten Virus zu erzeugen. Der T7-Promotor wurde direkt vor der 5'UTR-Sequenz platziert und eine einzigartige Restriktionsstelle EAG1 wurde direkt hinter dem Poly(A)-Schwanz platziert.

Virusfragmente wurden entweder durch RT-PCR auf RNA, die aus von Delta infizierten Vero-E6-Zellen extrahiert wurde, unter Verwendung des SuperScript IV VILO Master Mix (11756050, Thermofisher) gemäß dem Herstellerprotokoll oder unter Verwendung synthetischer Gene (GeneArt, Life Technologies) erhalten. Alle PCR-Amplifikationen wurden mit Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (F530, Thermofisher) durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde in den Topo-TA-Vektor kloniert und seine Sequenzen durch Sanger-Sequenzierung kontrolliert. Das nLuc-Gen wurde stromaufwärts von ORF7a eingefügt und mithilfe eines GSG-Linkers und einer P2A-Peptidsequenz von diesem getrennt, um die Spaltung zwischen dem Reporter und dem viralen Protein zu vermitteln. Es wurde direkt im F10-1-Fragment synthetisiert.

Die Rekombination der 4 hefespezifischen Fragmente und der 11 viralen Fragmente wurde an S. cerevisiae BY4741 durchgeführt. Eine Hefekultur wurde aus einer Vorkultur über Nacht in YPDA-Medium (2 ml Vorkultur in 50 ml YPDA-Medium, erhitzt auf 30 °C) durchgeführt, bis die exponentielle Wachstumsphase erreicht war, mit einer optischen Dichte, die etwa 108 entsprach Zellen/ml. Die Hefen wurden durch Zentrifugation von 50 ml Kultur (3.000 × g bei 4 °C für 5 Minuten) geerntet, bevor sie ein erstes Mal in einer sterilen Lösung von Tris-EDTA und Lithiumacetat TE/LiAc (Tris-HCl pH 7,5 10 mM) gewaschen wurden ; EDTA pH 7,5 0,1 mM; LiAc 100 mM). Die Zellen wurden in 500 μl TE/LiAc-Lösung (2,109 Zellen/ml) resuspendiert. Die Hefesuspension wurde dann 30 Minuten lang ohne Rühren bei 30 °C inkubiert. In dieser Zeit wurde eine Mischung aller DNA-Fragmente im äquimolaren Verhältnis hergestellt. Für jede Rekombinationsbedingung wurden 50 μl kompetente Zellen (108 Zellen) in einem Endvolumen von 300 μl TE/LiAc/PEG-Lösung (100 mM Tris-HCl pH 8; 100 mM Lithiumacetat; 40 % v/v PEG 3350) resuspendiert ) mit dem zu rekombinierenden DNA-Mix und 50 µg denaturierter Lachssperma-DNA (31149, Sigma) versetzt und anschließend 5 min auf Eis gekühlt. Die Mischung wurde 30 Minuten lang ohne Rühren bei 30 °C inkubiert, bevor sie 20 Minuten lang einem Hitzeschock bei 42 °C unterzogen wurde. Nach dem Abkühlen auf Eis wurden die Hefen durch 5-minütige Zentrifugation bei 500 × g bei RT pelletiert und anschließend resuspendiert und mit 500 μl 5 mM CaCl2 10 Minuten bei RT inkubiert. CaCl2 wurde durch 5-minütige Zentrifugation bei 500 × g bei RT gewaschen und die Zellen wurden in 200 μl sterilem Wasser resuspendiert, bevor sie auf selektives synthetisches Minimalmedium ohne Histidin, Uracyl und Leucin (SD-His-Ura-Leu-) ausplattiert wurden 3 Tage lang bei 30 °C inkubiert. Für jede Transformation wurden zehn verschiedene Klone durch Multiplex-PCR (206143, Qiagen) auf schnellen DNA-Präparationen überprüft, die mit der bereits beschriebenen Chellex-Technik75 unter Verwendung spezifischer Primer (Ergänzungstabelle 1) durchgeführt wurden, um das Vorhandensein der verschiedenen Fragmente in der erwarteten Ausrichtung zu kontrollieren . Die interessierende Hefekolonie wurde in 200 ml SD-His-Ura-Leu-Medium subkultiviert und das Plasmid mit dem Qiagen Midi Prep Kit (12143, Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert.

Das Plasmid wurde durch EagI-HF (R3505, NEB)-Verdauung linearisiert, durch einen Phenol-Chloroform-Prozess gereinigt und in vitro mit dem T7 RiboMaxTM Large Scale RNA Production System (P1300, Promega) und dem m7G(5')ppp( 5')G-RNA-Cap-Struktur-Analog-Kits (#S1411, NEB). Ungefähr 5 μg lineare DNA wurden als Matrize in einem Reaktionsvolumen von 50 μl verwendet, bestehend aus: 10 μl 5X T7-Transkriptionspuffer; 5 μl m7G(50)ppp(50)G RNA-Cap-Analogstruktur bei 30 mM; 0,75 μL 100 mM GTP; 3,75 μL jedes Nukleotidtyps ATP, CTP; 100 mM UTP; und 5 μl RNasin T7 RNA-Polymerase-Enzym. Die Reaktion wurde 3 Stunden lang bei 30 °C inkubiert, dann wurde die Matrizen-DNA 20 Minuten lang bei 37 °C durch Zugabe von 2 μl des Enzyms RQ1 RNase-freie DNase verdaut. Die synthetisierte RNA wurde schließlich mit einer klassischen Phenol-Chloroform-Methode gereinigt und präzipitiert. Zwölf μg vollständige virale mRNA und 4 μg Plasmid, das für das virale Nukleoprotein (N)-Gen kodiert, wurden auf 8 × 106 Vero-E6-Zellen, resuspendiert in 0,8 ml Mirus Bio™ Ingenio™ Elektroporationslösung (MIR50114), unter Verwendung des Gene Pulser Xcell Electroporation elektroporiert System (1652660, Biorad) mit einem Impuls von 270 V und 950 μF. Die Zellen wurden dann in eine T75-Kulturflasche mit 15 ml DMEM, ergänzt mit 2 % FCS (v/v), überführt. Die elektroporierten Zellen wurden mehrere Tage lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert, bis der zytopathische Effekt (CPE) beobachtet wurde. Anschließend wurde der Überstand geerntet, aliquotiert und bis zur Titration bei –80 °C eingefroren. Die Virussequenz wurde durch NGS kontrolliert.

Vero-E6-Zellen (ATCC CRL-1586) wurden verwendet, um die Replikationskinetik verschiedener SARS-CoV-2-Varianten und rekombinanter Viren zu bewerten. Die Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Kulturmedium (DMEM, 31966-021, Gibco), ergänzt mit 5 % fötalem Kälberserum, bei 37 °C in 5 % CO2 gehalten. Am Tag vor der Infektion wurden 1 × 106 VeroE6-Zellen/Well auf 6-Well-Platten ausplattiert. Am Tag der Infektion wurden die Zellen mit dem SARS-CoV-2-Virus bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,01 in unabhängigen Dreifachansätzen infiziert und 24, 48 oder 72 Stunden nach der Infektion inkubiert. Die Überstände wurden zu jedem Zeitpunkt gesammelt und bei –80 ° C eingefroren. Virustiter wurden mit der klassischen TCID50-Methode an Vero-E6-Zellen 72 Stunden nach der Infektion ermittelt80.

Männliche Goldhamster (Mesocricetus auratus; RjHan:AURA) im Alter von 5–6 Wochen (Durchschnittsgewicht 60–80 Gramm) wurden von Janvier Laboratories gekauft und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen behandelt. Die Tiere wurden in Isolatoren in einer Einrichtung der Biosicherheitsstufe 3 untergebracht und manipuliert, mit freiem Zugang zu Wasser und Futter. Vor jeder Manipulation durchliefen die Tiere eine Eingewöhnungsphase von einer Woche. Die Tiere wurden mit einer intraperitonealen Injektion von 200 mg/kg Ketamin (Imalgène 1000, Merial) und 10 mg/kg Xylazin (Rompun, Bayer) sowie 100 µL physiologischer Lösung mit 6 × 104 PFU SARS-CoV-2 (wild) anästhesiert -Typ oder rekombinant) wurde jedem Tier intranasal verabreicht (50 µl/Nasenloch). Scheininfizierte Tiere erhielten nur die physiologische Lösung. Infizierte und scheininfizierte Hamster wurden in getrennten Isolatoren gehalten und vier Tage lang täglich nachuntersucht, wobei das Körpergewicht und der klinische Score notiert wurden. Der klinische Score basierte auf einer kumulativen Skala von 0 bis 4: zerzaustes Fell, langsame Bewegungen, Apathie, fehlende Erkundungsaktivität. Am Tag 3 nach der Infektion (dpi) wurden die Tiere einem Futtertest unterzogen, um den Geruchssinn wie zuvor beschrieben zu beurteilen14,81. Kurz gesagt, 24 Stunden vor dem Test wurden die Hamster nüchtern gehalten und dann einzeln für 10 Minuten in einen frischen Käfig (37 × 29 × 18 cm) mit sauberer Standardeinstreu gesetzt. Anschließend wurden die Hamster für 2 Minuten in einen anderen ähnlichen Käfig gesetzt, wobei etwa 5 Getreidestücke in einer 1,5 cm dicken Einstreu in einer Ecke des Testkäfigs versteckt wurden. Die getesteten Hamster wurden dann in die gegenüberliegende Ecke gestellt und die Latenzzeit bis zum Auffinden des Futters (definiert als die Zeit, um Getreide zu finden und mit dem Graben zu beginnen) wurde mit einem Chronometer aufgezeichnet. Der Test wurde über einen Zeitraum von 15 Minuten durchgeführt. Sobald das Futter freigelegt wurde, wurden die Hamster aus dem Käfig entfernt. Eine Minute später führten Hamster den gleichen Test durch, allerdings mit sichtbaren Schoko-Müsli auf der Einstreu. Die Tests wurden in speziell dafür ausgestatteten Isolatoren einer Biosicherheitsstufe 3-Anlage durchgeführt. Bei 4 dpi wurden die Tiere mit einem Überschuss an Anästhetika (Ketamin und Xylazin) eingeschläfert und ausgeblutet82, und Proben von Nasenmuscheln, Lungen und Riechkolben wurden gesammelt und sofort bei –80 °C eingefroren. Lungenfragmente wurden ebenfalls gesammelt und in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert.

Gefrorene Lungenfragmente, Nasenmuscheln und Riechkolben wurden gewogen und mit 1 ml eiskaltem DMEM, ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin (15140148, Thermo Fisher), in Lysing Matrix M 2 ml-Röhrchen (116923050-CF, MP Biomedicals) homogenisiert das FastPrep-24™-System (MP Biomedicals) und das folgende Schema: Homogenisierung bei 4,0 m/s während 20 Sekunden, Inkubation bei 4 °C während 2 Minuten und erneute Homogenisierung bei 4,0 m/s während 20 Sekunden. Die Röhrchen wurden 2 Minuten lang bei 4 °C mit 10.000 × g zentrifugiert und die Überstände gesammelt. Virustiter wurden mit der klassischen TCID50-Methode an Vero-E6-Zellen 72 Stunden nach der Infektion ermittelt80. Virale RNA-Beladungen wurden durch Quantifizierung genomischer und subgenomischer SARS-CoV-2-RNA basierend auf dem E-Gen83 ermittelt. Kurz gesagt, 125 µL der Überstände wurden mit 375 µL Trizol LS (10296028, Invitrogen) homogenisiert und die Gesamt-RNA wurde mit dem Direct-zol RNA MicroPrep Kit (R2062, Zymo Research: Nasenmuscheln und Riechkolben) oder dem MiniPrep Kit (R2052) extrahiert , Zymo Research: Lunge). Wir verwendeten die einstufige qRT-PCR von Taqman (Invitrogen 11732-020) in einem Endvolumen von 12,5 μl pro Reaktion in PCR-Platten mit 384 Vertiefungen unter Verwendung eines Thermocyclers (QuantStudio 6 Flex, Applied Biosystems). Kurz gesagt, 2,5 μL RNA wurden zu 10 μL eines Mastermixes hinzugefügt, der 6,25 μL 2X-Reaktionsmix, 0,2 μL MgSO4 (50 mM), 0,5 μL Superscript III RT/Platinum Taq Mix (2 UI/µL) und 3,05 enthielt μL nukleasefreies Wasser mit 400 nM Primern und 200 nM Sonde. Zum Nachweis der genomischen RNA verwendeten wir die E_sarbeco-Primer und -Sonde (E_Sarbeco_F1 5'-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3'; E_Sarbeco_R2 5'-ATATTGCAGCAGTACGCACCACA-3'; E_Sarbeco_Probe FAM-5'-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-3'-TAMRA). Der Nachweis subgenomischer SARS-CoV-2-RNA wurde durch Ersetzen des E_Sarbeco_F1-Primers durch den CoV2sgLead-Primer (CoV2sgLead-Fw 5′-CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTC-3‘) erreicht. Ein synthetisches Gen, das die PCR-Zielsequenzen kodiert, wurde bei Thermo Fisher Scientific bestellt. Ein PCR-Produkt wurde mit Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Fisher Scientific) amplifiziert und in vitro mit dem Ribomax T7 Kit (Promega) transkribiert. Die RNA wurde mit dem Qubit RNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) quantifiziert, normalisiert und als Standard zur Quantifizierung der absoluten Kopienzahl der RNA verwendet. Die Amplifikationsbedingungen waren wie folgt: 55 °C für 20 Minuten, 95 °C für 3 Minuten, 50 Zyklen von 95 °C für 15 Sekunden und 58 °C für 30 Sekunden; gefolgt von 40 °C für 30 s.

Bei 4 dpi gesammelte RNA-Präparate aus Lungen, Nasenmuscheln und Riechkolben wurden einer RT-qPCR unterzogen. Kurz gesagt: RNA wurde unter Verwendung des SuperScript™ IV VILO™ Master Mix (11766050, Invitrogen) revers in Erststrang-cDNA transkribiert. qPCR wurde in einem Endvolumen von 10 μl pro Reaktion in 384-Well-PCR-Platten unter Verwendung eines Thermocyclers (QuantStudio 6 Flex, Applied Biosystems) und der zugehörigen Software (QuantStudio Real-time PCR System, v.1.2, Applied Biosystems) durchgeführt. Kurz gesagt, 2,5 μl cDNA (12,5 ng) wurden zu 5 μl Taqman Fast Advanced-Mastermix (444457, Applied Biosystems) und 2,5 μl nukleasefreiem Wasser mit Primerpaaren des Goldhamsters gegeben (Ergänzungstabelle 2). Die Amplifikationsbedingungen waren wie folgt: 95 °C für 20 s und 45 Zyklen von 95 °C für 1 s und 60 °C für 20 s. Als Referenz dienten die Gene γ-Actin und Hprt (Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase). Variationen in der Genexpression wurden als n-fache Änderung der Expression in den Geweben der infizierten Hamster im Vergleich zu den Geweben der scheininfizierten Gruppe unter Verwendung der 2-ΔΔCt-Methode84 berechnet.

Für iDISCO+ wurden drei männliche und drei weibliche Hamster mit 6×104 PFU SARS-CoV-2 Wuhan infiziert und wie oben beschrieben weiterverfolgt. Bei 4 dpi wurden die Tiere mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (200 mg/kg; Imalgène 1000, Merial) und Xylazin (10 mg/kg; Rompun, Bayer) anästhesiert und wir führten eine transkardiale Perfusion mit Heparin enthaltendem DPBS (5 ×) durch 103 U/mL), gefolgt von 4 % neutral gepuffertem Formaldehyd. Die ganzen Köpfe wurden gesammelt und vor der Analyse eine Woche lang in 4 % neutral gepuffertem Formaldehyd gelagert. SARS-CoV-2-Nukleokapsid wurde vollständig in der Schnauze und im Gehirn infizierter Hamster mithilfe des zuvor veröffentlichten iDISCO+-Protokolls85 mit minimalen Modifikationen nachgewiesen. Alle Puffer wurden mit 0,01 % Natriumazid (Sigma-Aldrich) ergänzt. Die Schnauze, die die Riechschleimhaut und den Riechnerv enthält, und das Gehirn wurden getrennt seziert und verarbeitet, um die Gewebemanipulation zu optimieren.

Alle Proben wurden zunächst in Methanol (Sigma-Aldrich) unter Verwendung von 20-40-60-80-100-100 % Verdünnungen in destilliertem Wasser dehydriert (jede Konzentration 1 bis 2 Stunden). Eine komplexe Lipidentfernung wurde durch Inkubation der Proben in einer 2:1-Mischung aus Dichlormethan (Sigma-Aldrich) und Methanol über Nacht erreicht. Anschließend wurden die Proben zweimal in 100 %igem Methanol gewaschen und über Nacht mit einer 5 %igen H2O2-Lösung in Methanol gebleicht. Anschließend wurden alle Proben mit einer Methanolreihe (80-60-40-20 %) rehydriert. Um die Knochendurchlässigkeit zu erhöhen, wurden die Schnauzen durch Inkubation in der Morse-Lösung (Ameisensäure 45 % und Natriumcitrat 20 %) entkalkt. Schließlich wurden alle Proben (Gehirne und Schnauzen) in PBS, dann PBS-T (PBS mit 0,2 % Triton X-100 [Sigma-Aldrich]) gewaschen und in Permeabilisierungspuffer (20 % DMSO [Sigma-Aldrich]) inkubiert. und 2,3 % Glycin [Sigma-Aldrich] in PBS-T) bei 37 °C über Nacht. Vor der Immunfärbung wurden die Proben 24 Stunden lang bei 37 °C blockiert (0,2 % Gelatine [Sigma-Aldrich] in PBS-T). Um SARS-CoV-2 und das Gefäßsystem aufzudecken, wurden drei primäre Antikörper kombiniert: Kaninchen-Anti-SARS-CoV2-Nukleokapsid-Antikörper (GTX135357, GeneTex), 1:1000 verdünnt; Ziegen-Anti-CD31 (AF3628, R&D Systems), verdünnt 1:300; und Ratten-Anti-Podocalyxin (MAB1556, R&D Systems), verdünnt 1:1000. Nach einer zweiwöchigen Inkubation im Primärantikörper wurden die Proben gewaschen (PBS, ergänzt mit 0,2 % Tween-20 [Sigma-Aldrich] und 2 U/ml Heparin [Sigma-Aldrich]) und 10 Tage mit dem folgenden Sekundärantikörper inkubiert Antikörper: Esel-Anti-Kaninchen-Alexa 555 (A-31572, Thermo Fisher Scientific), Esel-Anti-Ziegen-Alexa 647 (A-21447, Thermo Fisher Scientific) und Huhn-Anti-Ratten-Alexa 647 (A-21472, Thermo Fisher Scientific), alle 1:500 verdünnt. Alle Antikörper wurden in Blockierungslösung verdünnt und bei 37 °C unter leichtem Schütteln inkubiert. Nach der Immunfärbung wurden die Proben gewaschen, in Methanol (20–40–60–80–100–100 %) dehydriert, 3 Stunden lang in einer 2:1-Mischung aus Dichlormethan und Methanol inkubiert und zweimal (jeweils 15 Minuten) in Dichlormethan gewaschen 100 % und durch Eintauchen in Dibenzylether geklärt.

Gehirn- und Schnauzenproben wurden mit einem LaVision Ultramicroscope II abgebildet, das mit unendlich korrigierten Objektiven, den Laserlinien OBIS-561 nm 100 mW und OBIS-639 nm 70 mW sowie 595/40- und 680/30-Filtern für Alexa 555 bzw. Alexa 647 ausgestattet war. Die Riechkolben wurden mit einem 4×0,35NA-Objektiv, einer Laser-NA von 0,3 und einer Schrittweite von 2 µm abgebildet, wodurch Bilder mit einer Auflösung von 1,63 × 1,63 × 2 µm/Pixel erhalten wurden. Die Schnauzen wurden mit einem 1,3-fachen Objektiv abgebildet, wobei die Laser-NA auf 0,3 und die Schrittgröße 5 µm eingestellt wurden, um Bilder mit einer Auflösung von 5 × 5 × 5 µm/Pixel zu erhalten. Alle Akquisitionen wurden mit der ImSpector-Software (v.7.0.127.0, Lavision Biotec GmbH) durchgeführt. Die erhaltenen 3D-Stapel wurden mit Bitplane Imaris 9.2 (Oxford Instruments) analysiert.

Bei 4 dpi wurden mit SARS-CoV-2/Wuhan_nLuc, Wuhan/ΔORF7ab_nLuc und SARS-CoV-2/Delta_nLuc infizierte Tiere mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (200 mg/kg; Imalgène 1000, Merial) und Xylazin (10 mg) anästhesiert /kg; Rompun, Bayer). Als nächstes wurden 0,45 µmol des nLuc-Substrats (Nano-Glo® In-vivo-Substrat, CS320501, Promega) Fluorfurimazin (FFz) interperitoneal injiziert und die Tiere wurden in eine Box gebracht und mit einem IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System (PerkinElmer) abgebildet ) innerhalb von 5 Minuten nach der FFz-Injektion. Es wurden zweidimensionale Biolumineszenzbilder aufgezeichnet und die Photonenemission in einem interessierenden Bereich, der mit der Living Image-Software (Version 4.7.4, PerkinElmer) definiert wurde, quantifiziert (p/s/cm2/sr). Nach der In-vivo-Bildgebung wurden die Tiere eingeschläfert, die Lungen und Gehirne entnommen und schnell in eine Platte mit sechs Vertiefungen gegeben. Die Platten wurden in eine Sicherheitsbox gelegt und wie oben beschrieben abgebildet.

Lungenfragmente, die 7 Tage in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert waren, wurden in Paraffin eingebettet. Vier µm dicke Schnitte wurden geschnitten und mit Hämatoxylin- und Eosin-Färbung gefärbt. IHC wurden auf Leica Bond RX unter Verwendung eines Anti-SARS-Nukleokapsidprotein-Antikörpers (1:500, NB100-56576, Novus Biologicals) und eines biotinylierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Ig-Sekundärantikörpers (1:600, E0432, Dako, Agilent) durchgeführt. Anschließend wurden die Objektträger mit dem Diascanner Axioscan Z1 (Zeiss) gescannt und die Bilder mit der Software Zen 2.6 (Zeiss) analysiert.

Menschliche neurale Stammzellen (hNSC, ENStem-A, SCC003, EMD-Millipore) wurden in Geltrex-beschichteten 6-Well-Platten (A1413302, Gibco) in einer Dichte von 4,5 × 105 Zellen/cm2 in CTS Knock-out DMEM/F12 gehalten Medium (A1370801, Gibco), ergänzt mit 2 % StemPro-Neuralzusatz (A1050801, Gibco), 2 mM Glutamax (35050038, Gibco), 20 ng/ml FGFb (PHG0026, Gibco) und 20 ng/ml EGF (PHG0311, Gibco). 37 °C in 5 % CO2. A549-ACE2-TMPRSS2-Zellen (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Pr. Olivier Schwartz, Institut Pasteur) wurden in F12K Nut Mix-Medium (21127022, Gibco), ergänzt mit 10 % Rinderkalbsserum und 10 µg/ml Blasticidin (12172530, Gibco), bei 37 gehalten °C in 5 % CO2. Um die Neuronen-Epithel-Netzwerke zu erzeugen, verwendeten wir mikrofluidische Chips, die wir von MicroBrain Biotech (Brainies™, Cat#: MBBT5; Marly le Roi, Frankreich) erworben haben. Brainies™ MBBT5 ist ein Chip mit 4 neuronalen Dioden. Eine neuronale Diode umfasst zwei rechteckige Kulturkammern (Volumen ~1 µL), die jeweils mit zwei Reservoirs verbunden und durch eine Reihe von 500 µm langen asymmetrischen Mikrokanälen (3 µm hoch, von 15 µm auf 3 µm verjüngend) getrennt sind36. Brainies™ wurden mit Poly-L-Ornithin (P4957, Sigma-Aldrich) und Laminin (L2020, Sigma-Aldrich) beschichtet und 1 × 105 hNSCs wurden sowohl in der rechten als auch in der linken Kammer ausgesät und bei 37 °C in 5 % inkubiert. CO2 für 24 Stunden. Das Medium wurde dann durch ein neuronales Differenzierungsmedium ersetzt, bestehend aus neurobasalem Medium (10888022, Gibco), ergänzt mit 2 % B27-Ergänzung (17504044, Gibco), 1 % CultureOne-Ergänzung (A3320201, Gibco), 2 mM Glutamax (35050038, Gibco). und 200 µM Ascorbinsäure (A4403, Sigma Aldrich) und 14 Tage lang bei 37 °C in 5 % CO2 inkubiert, wobei jeden zweiten Tag die Hälfte des Mediums ausgetauscht wurde. Schließlich wurden 2 × 104 A549-ACE2-TMPRSS2-Zellen über die Neuronen sowohl in der rechten als auch in der linken Kammer in neuronalem Differenzierungsmedium bei 37 °C in 5 % CO2 für 48 Stunden gegeben. Um die retrograde axonale Bewegung von SARS-CoV-2 zu beurteilen, wurden die rechten Kammern mit einer MOI von 1 von SARS-CoV-2 Wuhan, Wuhan/ΔORF7ab, Gamma, Delta oder Omicron/BA.1 infiziert und bei 37 °C inkubiert C in 5 % CO2 für 72 Stunden. Um die anterograde axonale Bewegung von SARS-CoV-2 zu beurteilen, wurden die linken Kammern unter den gleichen oben genannten Bedingungen infiziert. Um eine passive Diffusion von Baugruppen zu verhindern, wurde hydrostatischer Druck durch Hinzufügen eines Medienüberschusses in die Reservoirs der Aufnahmekammern ausgeübt86. Um den axonalen retrograden Transport zu blockieren, wurden dem Medium während der Infektion und während der gesamten Inkubationszeit 100 µM Ciliobrevin D (250401, Calbiochem) zugesetzt. Anschließend wurden die Zellen mit 4 % PFA (15444459, Thermo Scientific) fixiert, in PBS gewaschen, 10 Minuten lang mit 0,5 % Triton während 30 Minuten, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern: Maus-Anti-β-Tubulin III (neuronaler) Antikörper (1:1000, T8578, Sigma-Aldrich) und Kaninchen-Anti-SARS-CoV-2-Nukleokapsid-Antikörper (1 :1000, GTX135361, GeneTex). Anschließend wurden die Zellen in PBS gewaschen und mit den folgenden Sekundärantikörpern inkubiert: Ziegen-Anti-Maus-AlexaFluor 647 (1:1000, A21235, Invitrogen) und Ziegen-Anti-Kaninchen-AlexaFluor 546 (1:1000, A11035, Invitrogen) für 2 Stunden bei 4 °C. Anschließend wurden die Zellen gewaschen, die Kerne mit 20 µM Hoechst 33342 (62249, Thermo Scientific) angefärbt und in PBS gelagert. Die Bilder wurden mit dem Zellbildgebungssystem EVOS FL (Thermo Scientific) mit den Objektiven 10x oder 20x und den Fluoreszenzwürfeln DAPI, RFP und CY5.5 aufgenommen. Mit der gleichen beschriebenen Methode wurden auch Neuronen-Epithel-Netzwerke in Mikrofluidikgeräten mit den rekombinanten Viren Wuhan_nLuc, Wuhan/ΔORF7ab_nLuc und Delta_nLuc bei einem MOI von 0,5 infiziert (maximale Volumenbegrenzung aufgrund des Stammvirustiters). Die Nanoluciferase-Aktivität in den Überständen wurde nacheinander bei 1, 2 und 3 dpi bewertet. Kurz gesagt wurden 20 µL Überstand mit 20 µL nLuc-Substrat (N1110, Promega) in einer weißen 96-Well-Platte gemischt und die Lumineszenz, ausgedrückt als Relative Light Unit (RLU), während 100 ms mit dem VICTOR Nivo Plate Reader erfasst , und die Victor Nivo-Steuerungssoftware (v.4.0.7, Perkin Elmer).

Die statistische Analyse wurde mit Prism 9 (GraphPad, Version 9.5.1, San Diego, USA) durchgeführt, wobei p < 0,05 als signifikant angesehen wurde. Quantitative Daten wurden gruppenübergreifend mithilfe des Log-Rank-Tests, des zweiseitigen Mann-Whitney-Tests oder des Kruskal-Wallis-Tests verglichen, gefolgt vom Dunn-Mehrfachvergleichstest. Mithilfe der Hauptkomponentenanalyse wurden multivariate statistische Analysen zu klinischen Parametern und zur Gewebeentzündung durchgeführt. Randomisierung und Verblindung waren aufgrund vordefinierter Haltungsbedingungen (getrennte Isolatoren zwischen infizierten und nicht infizierten Tieren) nicht möglich. Ex-vivo- und In-vitro-Analysen waren verblindet (kodierte Proben). Für In-vivo-Experimente wurden 2 unabhängige Replikate mit jeweils 4 Tieren durchgeführt; Für In-vitro-Experimente wurden 3 unabhängige Replikate durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle relevanten Daten, die die wichtigsten Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Hauptmanuskript und seinen Zusatzinformationen verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Der SARS-CoV-2-Stamm wurde vom Nationalen Referenzzentrum für Atemwegsviren bereitgestellt, das vom Institut Pasteur (Paris, Frankreich) betrieben und von Pr. geleitet wird. Sylvie van der Werf. Die menschliche Probe, aus der der Stamm 2019-nCoV/IDF0372/2020 isoliert wurde, wurde von Pr. zur Verfügung gestellt. X. Lescure und Pr. Y. Yazdanpanah vom Bichat-Krankenhaus (Paris, Frankreich). Die menschliche Probe des Stammes hCoV-19/Japan/TY7-501/2021 (Gamma-Variante, JPN [P.1]) wurde vom japanischen Nationalen Institut für Infektionskrankheiten (Tokio, Japan) bereitgestellt. Das Isolat SARS-CoV-2 Delta/2021/I7.2 200 (Delta-Variante, GISAID-ID: EPI_ISL_2029113), das Isolat SARS-CoV-2 Omicron/B.1.1.529 (Omicron BA.1-Variante, GISAID-ID: EPI_ISL_6794907). ) und die A549-ACE2-TMPRSS2-Zellen wurden von der Virus- und Immunitätseinheit des Institut Pasteur unter der Leitung von Pr. bereitgestellt. Olivier Schwartz. Wir danken Sanjay Vashee vom J. Craig Venter Institute (Rockville, MD, USA) für das YCpBAC-his3-Plasmid. Diese Arbeit wurde von der Task Force SARS-CoV-2 des Institut Pasteur (NeuroCovid-Projekt), von der SARS-CoV-2-gemeinsamen Ausschreibung Institut Pasteur - Paris Brain Institute (CoVessel-Projekt) und vom Programm Fédérateur de Recherche 1 (PFR-1) des Institut Pasteur unterstützt - Reverse Genetik). GDM dankt der Fondation pour la Recherche Médicale für die Finanzierung (Grant ANRS MIE202112015304). VP ist Empfänger eines Stipendiums des Rahmenprogramms für Forschung und Innovation Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der spezifischen Finanzhilfevereinbarung Nr. 945539 (Human Brain Project SGA3). FA ist Empfänger eines Stipendiums aus dem Programm Fédérateur de Recherche 5 (PFR-5 – Functional Genomics of the Viral Cycle) des Institut Pasteur. AC dankt für die Finanzierung durch den Brain Axis SRA3 M2 Master Student Call 2022-2023 des Institut Pasteur. ESL und RK danken der Task Force des Institut Pasteur (Projekt SABSOS) für ihre Unterstützung. ESL dankt für die Finanzierung durch das INCEPTION-Programm (Investissements d'Avenir-Stipendium ANR-16-CONV-0005). Wir möchten Yves Jacob für die fruchtbaren Diskussionen über SARS-CoV-2 ORF7 danken. Wir danken Etienne Jacotot für seine Einblicke in neuronale Kulturen in mikrofluidischen Kammern sowie Bernadette Bung von MicroBrain Biotech. Wir danken außerdem Johan Bedel für die Hilfe bei der Histopathologie und Emeline Perthame für ihre Einblicke in statistische Analysen. Ein Teil dieser Arbeit wurde auf der UtechS Photonic BioImaging (PBI)-Plattform durchgeführt, die vom Institut Pasteur und der Région Ile-de-France (Programm DIM1Health) unterstützt wird.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Victoire Perraud, Flavio Alvarez, Alba Vieites-Prado.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Florence Larrous, Hervé Bourhy.

Institut Pasteur, Universität Paris Cité, Abteilung für Lyssavirus-Epidemiologie und Neuropathologie, F-75015, Paris, Frankreich

Guilherme Dias de Melo, Victoire Perraud, Seonhee Kim, Lauriane Kergoat, Anthony Coleon, Florence Larrous und Hervé Bourhy

Institut Pasteur, Universität Paris Cité, Abteilung Kanalrezeptoren, F-75015, Paris, Frankreich

Flavio Alvarez & Nicolas Wolff

Universität Sorbonne, Doctoral College, F-75005, Paris, Frankreich

Flavio Alvarez

Institut für Gehirn und Rückenmark, Labor für strukturelle Plastizität, Universität Sorbonne, INSERM U1127, CNRS UMR7225, 75013, Paris, Frankreich

Alba Vieites-Prado & Nicolas Renier

Institut für Virologie und Immunologie (IVI), Bern, Schweiz; Abteilung für Infektionskrankheiten und Pathobiologie, Vetsuisse-Fakultät, Universität Bern, Bern, Schweiz

Bettina Salome Trüeb

Institut Pasteur, Universität Paris Cité, Plattform für Histopathologie, F-75015, Paris, Frankreich

Magali Tichit & David Hardy

Institut Pasteur, Universität Paris Cité, Labor für räumliche Regulierung des Genoms, F-75015, Paris, Frankreich

Aurèle Piazza, Agnès Thierry & Romain Koszul

Institut Pasteur, Université Paris Cité, Abteilung Molekulargenetik von RNA-Viren, F-75015, Paris, Frankreich

Sandie Munier

Institut Pasteur, Université Paris Cité, Gruppe Evolutionäre Genomik von RNA-Viren, F-75015, Paris, Frankreich

Etienne Simon-Lorière

Multidisziplinäres Zentrum für Infektionskrankheiten, Universität Bern, Bern, Schweiz

Volker Thiel

Institut Pasteur, Universität Paris Cité, Inserm U1117, Abteilung Biologie der Infektion, 75015, Paris, Frankreich

Marc Lecuit

Universitätskrankenhaus Necker-Enfants Malades, Abteilung für Infektionskrankheiten und Tropenmedizin, APHP, Institut Imagine, 75006, Paris, Frankreich

Marc Lecuit

Institut Pasteur, Universität Paris Cité, Abteilung Wahrnehmung und Gedächtnis, F-75015 Paris, Frankreich; CNRS UMR3571, 75015, Paris, Frankreich

Pierre-Marie Lledo

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Konzeptualisierung: GDM, FL und HB Methodik: GDM, RK, VT, NR und FL Untersuchung: GDM, VP, FA, AVP, SK, LK, AC, MT, AP und AT Finanzierungsakquise: GDM, ML, PML , NR, FL und HB Ressourcen: BST, DH, NW, SM, RK, ESL, NR, VT und FL Betreuung: HB Writing – Originalentwurf: GDM und HB Writing – Review & Editing: alle Autoren.

Korrespondenz mit Hervé Bourhy.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Rouhollah Habibey und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

de Melo, GD, Perraud, V., Alvarez, F. et al. Neuroinvasion und Anosmie sind unabhängige Phänomene bei einer Infektion mit SARS-CoV-2 und seinen Varianten. Nat Commun 14, 4485 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40228-7

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Eingegangen: 17. Oktober 2022

Angenommen: 11. Juli 2023

Veröffentlicht: 26. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40228-7

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