Quantifizierung der Stoffwechselaktivität von Ascaris suum L3 mittels Resazurin-Reduktion

Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 243 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Helmintheninfektionen stellen ein wichtiges Problem für die öffentliche Gesundheit des Menschen dar und haben noch größere Auswirkungen auf das Wohlergehen von Haustieren und Nutztieren. Aktuelle Indikatoren für Anthelminthika-Arzneimittel-Screening-Assays sind die Stadiumsentwicklung, Migration oder Motilität, die subjektiv, mühsam und von geringem Durchsatz sein können. Das Ziel dieser Studie war die Anwendung und Optimierung einer fluorometrischen Technik unter Verwendung von Resazurin zur Bewertung von Veränderungen in der Stoffwechselaktivität von Ascaris suum-Larven im dritten Stadium (L3), einem Parasiten von hoher wirtschaftlicher Bedeutung bei Schweinen.

Ascaris suum L3 wurden mechanisch aus 6 bis 8 Wochen embryonierten und mit Saccharosegradienten angereicherten Eiern geschlüpft. Resazurin-Farbstoff und A. suum L3 wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen titriert und die Resazurin-Reduktionsaktivität wurde durch Fluorometrie nach 24-stündiger Inkubation bewertet. Zur Lokalisierung der Resazurin-Reduktionsstelle innerhalb der Larven wurde Fluoreszenzmikroskopie verwendet. Schließlich setzten wir A. suum L3 verschiedenen Stressbedingungen aus, darunter Hitze, Methanol und Anthelminthika, und untersuchten deren Einfluss auf den Larvenstoffwechsel durch Resazurin-Reduktionsaktivität.

Wir zeigen, dass der nicht fluoreszierende Farbstoff Resazurin im lebenswichtigen A. suum L3 zu fluoreszierendem Resorufin reduziert und in das Kulturmedium freigesetzt wird. Optimale Testparameter sind 100–1000 L3 pro Vertiefung, eine Resazurin-Konzentration von 7,5 µg/ml und eine Inkubation bei 37 °C/5 % CO2 für 24 Stunden. Eine intakte L2-Hülle um die L3 von A. suum verhindert die Aufnahme von Resazurin vollständig, während bei nicht ummantelter L3 das stärkste Fluoreszenzsignal entlang des Mitteldarms der Larve beobachtet wird. L3, die Methanol oder Hitze ausgesetzt sind, zeigen eine allmählich verringerte Resazurin-Reduktionsaktivität. Darüber hinaus verringerte die 24-stündige Exposition gegenüber Ivermectin in einer Konzentration von 0,625 µM, Mebendazol in einer Konzentration von 5 µM und Thiabendazol in einer Konzentration von 10 bis 100 µM die Stoffwechselaktivität der Larven signifikant um 55 %, 73 % bzw. 70 % bis 89 %.

Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse, dass sowohl Stoffwechselstressoren als auch Anthelminthika die Resazurin-Reduktionsaktivität von A. suum L3 signifikant und reproduzierbar reduzieren, was den vorgeschlagenen Test zu einer empfindlichen und einfach anzuwendenden Methode zur Bewertung der Stoffwechselaktivität von A. suum L3 in vitro macht .

Die Bekämpfung gastrointestinaler Nematoden beruht sowohl bei Menschen als auch bei Tieren hauptsächlich auf einer Chemotherapie. Allerdings schärfen wiederkehrende Behandlungen und erneute Infektionen, die Einschränkung der derzeit verfügbaren Anthelminthika-Arzneimittelklassen [49], zunehmende Berichte über eine verringerte Arzneimittelwirksamkeit und die sich entwickelnde Resistenz gegen erstklassige Anthelminthika wie Benzimidazole und Ivermectin das Bewusstsein für die Bedeutung der Anthelminthika-Arzneimittelforschung [19, 22]. , 30, 38]. Die schnelle Entdeckung neuer Medikamente gegen bodenübertragene Helminthen (STHs) wird hauptsächlich durch das Fehlen objektiver Hochdurchsatz-Screeningmethoden zur Beurteilung der Medikamentenwirksamkeit behindert [1, 20, 47].

Die mikroskopische Beurteilung von Motilität und Morphologie dominiert die derzeit verwendeten Methoden zur Bewertung der Arzneimittelwirksamkeit bei Larven. Diese Ansätze sind im Allgemeinen zeitaufwändig, mühsam und anfällig für Subjektivität und daher nicht für Hochdurchsatz-Screening geeignet. Geräte wie das xCELLigence System [40] und das wMicroTracker System™ [24, 37] wurden für das Hochdurchsatz-Arzneimittelscreening mit Caenorhabditis elegans und einigen parasitären Helminthenarten validiert, die Auslesung beschränkt sich jedoch ausschließlich auf die Fortbewegungsaktivität. Daher werden kombinatorische Ansätze diskutiert, die beim Screening nach neuen Arzneimittelkandidaten mehrere Parameter berücksichtigen, wie z. B. eine allgemeine Anzeige wie Fortbewegungsaktivität in Kombination mit einer spezifischen Anzeige für den mutmaßlichen Wirkmechanismus, wie z. B. elektrophysiologische oder metabolische Aktivität [12].

Zusätzlich zur Motilität kann die Lebensfähigkeit von Nematoden mithilfe von Indikatorfarbstoffen für die Stoffwechselaktivität bewertet werden, die von den Larvenstadien in ein messbares Produkt umgewandelt werden. Für Helminthen wurden verschiedene Stoffwechselindikatoren getestet, beispielsweise der Tetrazoliumfarbstoff 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT), Fluoresceindiacetat (FDA) und para-Nitrophenylphosphat (pNPP). ) [34] und der zelldurchlässige Farbstoff Resazurin. Resazurin basiert auf der NADPH-abhängigen Reduktion von Resazurin zu Resorufin und wird häufig zur Überwachung des Zellwachstums und des Zellstoffwechsels von Säugetieren in einer Vielzahl von Zielen eingesetzt [23]. Der Resazurin-Reduktionstest wurde bisher für das Arzneimittelscreening bei erwachsenen Schistosoma-Arten (25, 26) sowie bei Larven im vierten Stadium (L4) und erwachsenen Trichuris muris (39) angepasst. Nach unserem besten Wissen liegen Daten zum Potenzial des Resazurin-Reduktionstests bei Ascaris spp. vor. Parasiten fehlen, obwohl es sowohl beim Menschen als auch beim Schwein zu den häufigsten STH weltweit gehört [15, 17, 51].

In dieser Studie passen wir den Resazurin-Reduktionstest für Ascaris suum-Larven im dritten Stadium (L3) an und bewerten ihn. Wir zeigen, dass das nicht fluoreszierende Resazurin von lebensfähigen Larven ohne Hülle aufgenommen wird. Resazurin wird hauptsächlich im Mitteldarm der Larve zu fluoreszierendem Resorufin reduziert und in das Kulturmedium freigesetzt. Die Exposition gegenüber häufig verwendeten Anthelminthika oder Bedingungen, die den Stoffwechsel von A. suum L3 beeinträchtigen, wurden sorgfältig bewertet und führten zu konsistenten und allmählichen Veränderungen der Resazurin-Reduktionsaktivität. Daher ist der Resazurin-Reduktionstest ein vielversprechendes Instrument zur Ergänzung gängiger Arzneimittel-Screening-Methoden zum Nachweis direkter Auswirkungen auf die Stoffwechselaktivität von A. suum L3.

Erwachsene A. suum-Würmer wurden nach der Schlachtung alle zwei Monate in einem Schlachthof in Brandenburg (Deutschland) eingesammelt. Die Sammlung erfolgte an Tagen, an denen überwiegend Bio-Tiere geschlachtet wurden. Jede Wurmcharge enthielt 100–300 Würmer unterschiedlicher Größe von verschiedenen Schweinen. Bewegliche weibliche Würmer wurden abgetrennt und mehrmals in vorgewärmter (37 °C) 0,9 %iger NaCl-Lösung gewaschen. Die Würmer wurden in Glasflaschen mit einer Dichte von vier Würmern pro 200 ml ausgewogener Hanks-Salzlösung, ergänzt mit Antibiotika (HBSS-AB: 127 mM NaCl, 7,5 mM NaHCO3, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 × 6), überführt H2O), ergänzt mit 200 U/ml Penicillin, 200 μg/ml Streptomycin, 2,5 μg/ml Amphotericin B und 50 μg/ml Gentamycin (PAN-Biotech GmbH, Deutschland) und bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Nach 24 Stunden wurden die Würmer in frisches Kulturmedium überführt, die ausgeschiedenen Eier geerntet und auf einem 30-µm-Zellsieb (Miltenyi Biotec) gesammelt und durch Spülen des Siebs mit 50 ml HBSS gewaschen. Anschließend wurden die Eier 6–8 Wochen lang bei 33 °C in 50 ml destilliertem Wasser (dH2O) mit 0,1 % Formaldehyd embryoniert und vor Licht geschützt. Der Embryonierungsstatus wurde mikroskopisch beurteilt.

Während der Embryonierung (0–6 Wochen) wurde jede Woche eine Probe mit 10.000–30.000 A. suum-Eiern für die durchflusszytometrische Analyse mit einem FACS Canto II (BD Biosciences) und BD FACSDiva Software v8.0 entnommen. Ohne weitere Färbung wurden die Vorwärts- (Größe) und seitlichen Streueigenschaften (Körnigkeit) jeder Probe aufgezeichnet und mit der Software FlowJo v10 (Tree Star) bewertet.

Typischerweise schwanken die Embryonierungsraten von A. suum nach 6–8 Wochen Embryonierung zwischen 50 und 95 % [10, 33] aufgrund einiger unbefruchteter Eier und Eiern, die in der Eisuspension unentwickelt bleiben. Um diese Heterogenität im Ausgangsmaterial zu überwinden, wurden vollständig embryonierte A. suum-Eier mithilfe eines Saccharose-Dichtegradienten gereinigt. Um die Klebrigkeit der Eier und die Varianz der Eidichte zu verringern, wurde die Uterusschicht entfernt, indem die Eier dreimal mit dH2O (200 × g bei Raumtemperatur [RT] für 2 Minuten) gewaschen und anschließend in einem Wasserbad bei 37 °C inkubiert wurden 5 % HClO (2,4-fache Verdünnung der 12 %igen HClO-Stammlösung) für 5 Minuten. Anschließend wurden die Eier fünfmal mit 50 ml 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) (200 × g bei Raumtemperatur für 2 Minuten) gewaschen und in 5 ml dH2O resuspendiert. Ein Saccharosegradient (18 % (Gew./Vol.), 20 %, 23 %, 25 % je 10 ml) wurde unter Verwendung der Unterschichtungsstufengradiententechnik hinzugefügt. Der Saccharosegradient wurde 1 h bei 2000 xg bei Raumtemperatur in einem Ausschwingrotor (ohne Bremse und sanfte Beschleunigung) zentrifugiert. Vollständig embryonierte Eier wurden mit einer 20-ml-Spritze mit aufgesetzter G20 × 2¾″-Nadel von der Oberseite der 23 % und 25 % Saccharoseschichten entnommen, fünfmal mit HBSS-AB gewaschen und zur weiteren Verwendung gepoolt.

Vier Milliliter gereinigte Eisuspension wurden in einen 100-ml-Erlenmeyerkolben mit 9 g Glasperlen überführt und 30 Minuten lang auf einen Schüttler (100 U/min, 37 °C) gestellt. Diese mechanische Behandlung führt zu Schlupfraten von etwa 90 %. Geschlüpfte A. suum L3 wurden auf einem 30-µm-Zellsieb gesammelt, das dann in eine Platte mit sechs Vertiefungen mit HBSS-AB gegeben und 3 Stunden lang bei 37 °C inkubiert wurde, damit lebensfähige Larven durch das Sieb wandern konnten. Nach der Migration wurden die Larven gesammelt, zweimal in HBSS-AB (200 × g bei Raumtemperatur für 2 Minuten) gewaschen und gezählt.

Resazurin (Acros Organics BV, Belgien) wurde in HBSS-AB gelöst, um eine Stammkonzentration von 150 µg/ml herzustellen. Die Stammlösung wurde 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 äquilibriert, aliquotiert und zur weiteren Verwendung bei –20 °C gelagert. Fluoreszenzemissionsspektren von Resazurin und Resorufin wurden mit einem Fluorimeter (Cary Eclipse, Agilent) gemessen.

Um die optimale Resazurin-Konzentration zu titrieren, wurde 15 µg/ml Resazurin-Stammlösung seriell verdünnt (acht zweifache Verdünnungsschritte) und 10 µl jeder Verdünnung in jede Vertiefung einer klaren 96-Well-Platte mit flachem Boden gegeben, die jeweils 500 A enthielt .Lösung von L3 in 90 µl HBSS-AB. Die Platte wurde 24 Stunden lang bei 37 °C/5 % CO2 inkubiert und die Fluoreszenzintensität wurde bei λem = 590 nm nachgewiesen (Synergy H1, BioTek, λex = 540 nm). Um das durch die larvenabhängige Resazurin-Reduktion erzeugte Fluoreszenzsignal zu quantifizieren, wurde die Fluoreszenzanzeige von einer Basiskontrolle ohne A. suum-Larven abgezogen.

Um die optimale Larvenzahl zu ermitteln, wurde eine zweifache Reihenverdünnung mit einem Bereich von 1000 bis vier A. suum L3/Vertiefung hergestellt. Jeder Vertiefung wurde Resazurin in einer Endkonzentration von 7,5 µg/ml zugesetzt. Die Platte wurde 24 Stunden lang inkubiert und die Fluoreszenzintensität wurde wie oben bestimmt.

Um hitzebedingten Veränderungen der Stoffwechselaktivität entgegenzuwirken, wurden 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 L3 in 500 µl HBSS-AB in ein Wasserbad gegeben und für unterschiedliche Zeiträume (1 bis 8 Minuten) bei 60 °C inkubiert und bei 60 °C stehen gelassen RT für 20 Minuten vor der Übertragung von L3 in eine 96-Well-Platte mit einem Endvolumen von 100 µl/Well in dreifacher Ausfertigung. Resazurin wurde in einer Endkonzentration von 7,5 µg/ml in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde 24 Stunden lang bei 37 °C/5 % CO2 inkubiert und die Fluoreszenzintensität wurde wie oben beschrieben gemessen. Um Methanol-induzierte Veränderungen der Stoffwechselaktivität der Larven zu bewerten, wurden 500 L3/Well 3 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 in HBSS-AB mit 1,5, 3, 6, 12 oder 25 % (v/v) Methanol inkubiert in dreifacher Ausführung. Die Platte wurde 24 Stunden lang inkubiert, bevor die Fluoreszenzintensität bestimmt wurde.

Um die Auswirkungen des Lösungsmittels Dimethylsulfoxid (DMSO) und der Anthelminthika auf die Stoffwechselaktivität der Larven zu untersuchen, wurden DMSO-Konzentrationen (Sigma-Aldrich, USA) im Bereich von 0,5 bis 4 % (v/v) (Endkonzentrationen) getestet. Die maximal löslichen Konzentrationen der Anthelminthika wurden mithilfe eines modifizierten turbidimetrischen Löslichkeitstests ermittelt [35]. Kurz gesagt, Stammkonzentrationen von Ivermectin (10 mM), Mebendazol (10 mM) und Thiabendazol (100 mM) in 100 % DMSO wurden in DMSO unter Verwendung von acht zweifachen Verdünnungsschritten seriell verdünnt. Fünf Mikroliter jedes Verdünnungsschritts wurden in 995 µL H2O in einer 1-ml-Küvette überführt und die Trübung bei λ = 600 nm gemessen. Für anthelmintische Behandlungen wurden 6,25 µM Ivermectin (Sigma-Aldrich, USA) und 50 µM Mebendazol (Sigma-Aldrich, USA) in 5 % (v/v) DMSO in HBSS-AB gelöst, um 10-fache Stammlösungen herzustellen. Thiabendazol (Sigma-Aldrich Corp., USA) wurde mit 1 mM, 0,1 mM und 0,01 mM in 5 % DMSO in HBSS-AB gelöst. Zehn Mikroliter jeder DMSO-Verdünnung oder Arzneimittelstammlösung wurden in die Vertiefungen einer klaren Platte mit 96 Vertiefungen und flachem Boden gegeben, die jeweils 500 A. suum L3 in 90 µl HBSS-AB enthielten. Die Platten wurden 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Anschließend wurden 5,3 µl Resazurin (Endkonzentration 7,5 µg/ml) in jede Vertiefung gegeben und die Platten 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Fluoreszenzintensität wurde wie oben beschrieben erfasst.

Um den Ort der Resazurin-Reduktion innerhalb der Larven zu bestimmen, wurden A. suum L3 3 Stunden lang in HBSS-AB mit 7,5 µg/ml Resazurin bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Die Larven wurden dreimal mit eiskaltem dH2O gewaschen und mit einem Fluoreszenzmikroskop (Axio Vert.A1 mit Colibri 7, Zeiss) unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von λex = 555 nm und einem Bandpassfilter von λem = 579–604 nm abgebildet. Um das Rachenpumpen in geschlüpftem A. suum L3 zu überprüfen, wurden die Larven 3 Stunden lang in HBSS-AB mit 10 mg/ml Fluorescein-konjugiertem Rinderserumalbumin (FITC-BSA; Thermo Fisher Scientific Inc., USA) inkubiert und anschließend dreimal gewaschen in eiskaltem dH2O [7]. Die Fluoreszenz wurde mit einer Anregungswellenlänge von λex = 475 nm und einem Bandpassfilter von λem = 500–525 nm (Axio Vert.A1 mit Colibri 7, Zeiss) nachgewiesen.

Für die Regressionsanalyse und den Gruppenvergleich wurde GraphPad Prism 9 verwendet. Für die aus dem L3-Titrationsexperiment erhaltenen Daten wurde ein lineares Regressionsmodell und für die aus dem Resazurin-Titrationsexperiment erhaltenen Daten ein hyperbolisches Regressionsmodell verwendet. Die Regressionsparameter wurden mithilfe der Methode der kleinsten Quadrate geschätzt. Regressionsmodelle galten als den Daten angemessen, wenn R2 über 0,8 lag. Ein gepaarter Student-T-Test wurde verwendet, um die statistische Signifikanz der Menge an Resorufin zu analysieren, die von den Larven in die Medien freigesetzt wurde. Nach einer einfachen einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) wurde der Dunnett-Test verwendet, um Fluoreszenzintensitätsdaten zu vergleichen, die aus den Experimenten erhalten wurden, in denen der Einfluss von Hitze, Methanol, DMSO und Thiabendazol auf L3 gemessen wurde. Der statistische Einfluss von Ivermectin und Mebendazol wurde mithilfe eines ungepaarten T-Tests analysiert.

Die kontinuierliche Embryogenese von A. suum-Eiern führt zu einer heterogenen Mischung von Entwicklungsstadien wie unbefruchteten Eiern, Eiern im 1–8-Zellen-Stadium oder vollständig embryonierten Eiern in einer bestimmten Charge. Mithilfe der Durchflusszytometrie analysierten wir die Eimischung über einen Zeitraum von 6 Wochen während der Embryonierung. Die Analyse der Vorwärts- und Seitwärtsstreueigenschaften dieser Eier, die aus trächtigen weiblichen Uteri stammen, ergab allmähliche Veränderungen in der Eimorphologie, nämlich eine Zunahme der Eigröße bei gleichzeitiger Abnahme der Körnigkeit (Abb. 1a, b). Unter der Annahme, dass die Körnigkeit der Eier die Eidichte beeinflusst, verwendeten wir einen diskontinuierlichen, mehrschichtigen Saccharose-Dichtegradienten [25 % (w/v), 23 %, 20 %, 18 %], um die verschiedenen Embryonierungsstadien der Eier zu trennen. Der Saccharosegradient fraktionierte Eimischungen reproduzierbar in vier verschiedene Schichten und ein Pellet. Die mikroskopische Untersuchung (Abb. 1c) ergab, dass die von der Oberseite der beiden oberen Schichten (18 % und 20 % Saccharose) gesammelten Eier hauptsächlich Vorlarvenstadien enthielten, während das Pellet hauptsächlich aus unbefruchteten Eiern und einigen bereits geschlüpften Larven bestand. Sowohl die 23-prozentige als auch die 25-prozentige Saccharoseschicht enthielten wiederum Eier mit voll entwickelten Larven im Inneren und einer hohen Reinheit von > 95 %. Bemerkenswert ist, dass die Larven in den Eiern, die wir sowohl aus der 23-prozentigen als auch aus der 25-prozentigen Saccharoseschicht erhielten, vollständig embryoniert schienen und daher gepoolt und für alle nachfolgenden In-vitro-Tests verwendet wurden.

Reinigung embryonierter A. suum-Eier mittels Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation. a Beispielhafte durchflusszytometrische Streudiagramme, die die Vorwärtsstreuung (FSC-A) und die Seitwärtsstreuung (SSC-A) von nicht embryonierten A. suum-Eiern in Suspension vor der Embryonierung (links) und einer gemischten Eisuspension nach 6 Wochen Embryonierung (rechts) darstellen. . b Histogramme wöchentlicher FSC/SSC-Messungen von A. suum-Eiern von Woche 0 bis Woche 6 nach Beginn der Embryonierung. c Arbeitsablauf zur Trennung vollständig embryonierter A. suum-Eier von unentwickelten Eiern. Vor der Gradientenreinigung wird die Uterusschicht entfernt. Gemischte Eisuspensionen werden mithilfe von vier Saccharoseschichten getrennt – 18 % (Gew./Vol.), 20 %, 23 % und 25 % – und die Eier werden für jede Schicht mikroskopisch beurteilt (schwarzer Maßstabsbalken: 50 µm).

Da die Lebensfähigkeit der Zellen durch Fluorometrie als Ergebnis der Diaphorase-Enzym-abhängigen Reduktion von Resazurin zu Resorufin gemessen werden kann (Abb. 2a), wollten wir analysieren, ob diese enzymatische Reaktion zum Nachweis der Stoffwechselaktivität von A. suum-Larven eingesetzt werden kann. Die Anregungswellenlänge für Resorufin liegt im Bereich von 530–570 nm. Für unsere Experimente stellten wir die Anregungswellenlänge auf 540 nm ein und maßen die Fluoreszenzemissionsspektren von Resorufin bei λex = 540 nm, um die maximale Intensität des Fluoreszenzsignals zu ermitteln, die bei 590 nm lag (Abb. 2b).

Ascaris suum L3 reduziert den Stoffwechselindikatorfarbstoff Resazurin. eine biochemische Reaktion, bei der der nicht fluoreszierende Farbstoff Resazurin (blau) zu fluoreszierendem Resorufin (rosa) reduziert wird. Die Reaktion erfordert die Anwesenheit von Diaphorase-Enzymen und NADH/H+. b Fluoreszenzemissionsspektren von Resazurin (blaue gestrichelte Kurve) und Resorufin (rosa durchgezogene Kurve) in HBSS-AB bei λex = 540 nm. c Die Titration von Resazurin von 0 bis 15 µg/ml mit einer festen Anzahl von 500 in vitro geschlüpften A. suum-Larven pro Vertiefung zeigt eine hyperbolische Beziehung (df = 7, R2 = 0,98, Best-Fit ½max = 1,6 µg/ml) . d Die Titration der L3-Zahlen von A. suum von 0 bis 1000 in vitro geschlüpftes L3 mit der festen Konzentration von 7,5 µg/ml Resazurin zeigt eine starke lineare Korrelation (R2 = 0,99, Gleichung: Y = 17,89x + 122,3, r = 0,99, mit P < 0,0001). c, d Fluoreszenzintensität gemessen bei λem = 590 nm und λex = 540 nm. Schwarze Punkte stellen die Fluoreszenzintensität einzelner Vertiefungen dar (n = 3 technische Replikate). Die graue Kurve stellt die Kurve der besten Anpassung dar (Methode der kleinsten Quadrate)

Titrationstests wurden durchgeführt, um optimale Bereiche sowohl der Resazurinkonzentration als auch der Anzahl der A. suum-Larven pro Test zu bestimmen. Die Resazurin-Konzentration wurde von 15 auf 0,06 µg/ml titriert, mit einer konstanten Anzahl von 500 Larven pro Vertiefung (Abb. 2c). Unter Verwendung der Methode der kleinsten Quadrate lieferte ein hyperbolisches Regressionsmodell die beste Anpassung mit R2 = 0,98 (df = 7, RFU = 16.657, 95 %-KI: RFU = 14.574–19.104). Basierend auf der erhaltenen hyperbolischen Regressionskurve lag die halbmaximale Resazurin-Konzentration bei 1,6 µg/ml (95 % KI: ½max = 1,038–2,44 µg/ml). Allerdings lieferte eine Resazurin-Konzentration von 7,5 µg/ml eine bessere Signalauflösung mit einer 1,83-fach stärkeren Signalintensität, ohne gleichzeitig die Larvenmotilität sichtbar zu beeinträchtigen. Um die optimale Larvenzahl zu titrieren, führten wir eine Reihenverdünnung von 1000 auf vier A. suum L3 mit einer konstanten Resazurin-Konzentration von 7,5 µg/ml durch (Abb. 2d). Unter Verwendung der Methode der kleinsten Quadrate lieferte ein einfaches lineares Regressionsmodell die beste Anpassung mit Y = 17,89x + 122,3. Darüber hinaus bestätigte die Pearson-Korrelationsanalyse eine starke lineare Beziehung zwischen der Anzahl der Larven und der Fluoreszenzintensität mit r = 0,99 und P < 0,0001. Wir haben festgestellt, dass 100 bis 1000 die optimale Anzahl von A. suum L3 sind, die in einem 96-Well-Assay verwendet werden.

Um zu beurteilen, ob sich das fluoreszierende Produkt Resorufin in den Larven ansammelt oder in das Medium freigesetzt wird, haben wir die Fluoreszenzintensität nach 24 Stunden mit A. suum L3 in den Vertiefungen gemessen und diese mit Überständen verglichen, aus denen L3 entfernt wurde (Abb. 3a). . Obwohl unsere Daten eine Abnahme der Fluoreszenzintensität zwischen beiden Messungen zeigten (gepaarter t-Test: n = 12, t = 3,774, df = 7, P = 0,0031), war die mittlere Fluoreszenzintensität nach Larvenentfernung im Vergleich zu um 3,8 % reduziert mittlere Fluoreszenzintensität von Mediumproben mit anwesenden Larven während der Messung. Somit wurde der überwiegende Teil des Resorufins im Medium nachgewiesen. Darüber hinaus zeigten die nach 24-stündiger Inkubation von 62, 125, 250 und 500 L3/96-Wells gesammelten Überstände kein nachweisbares Potenzial für die Reduktion von Resazurin zu Resorufin (Abb. 3b). Der letztgenannte Befund deutete darauf hin, dass Resazurin in den Larven reduziert wird.

Ascaris suum L3 reduziert Resazurin zu Resorufin und gibt den Großteil an die Medien ab. a Vergleich der Fluoreszenzintensität vor und nach Larvenentfernung: 500 A. suum L3 pro Vertiefung wurden nach 24-stündiger Inkubation mit 7,5 µg/ml Resazurin (+ Larven) und nach Entfernung von L3 (− Larven) gemessen. Beide Gruppen (n = 12 technische Replikate) wurden mithilfe des gepaarten t-Tests (t = 3,774, df = 11, P = 0,0031) verglichen. b Ausscheidungs-sekretorische (ES) Produkte von A. suum L3 wandeln Resazurin nicht in Resorufin um. Fluoreszenzintensität von ES-haltigen Überständen, gesammelt aus 62, 125, 250 und 500 L3/Well nach 24-stündiger Inkubation mit 7,5 µg/ml Resazurin. Das Streudiagramm zeigt den Mittelwert und die Standardabweichung (SD) (durchgezogene graue Linie) der relativen Fluoreszenzeinheiten (RFUs), schwarze Punkte stellen RFUs einzelner Vertiefungen dar und die gepunktete Linie stellt y = 0 dar; n = 3 technische Replikate

Als nächstes haben wir A. suum L3, das 3 Stunden lang mit Resazurin inkubiert wurde, mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet (Abb. 4a), um das Gewebe sichtbar zu machen, in dem die Resazurin-Reduktion in den Larven auftritt. Innerhalb von A. suum L3 beobachteten wir ein helles Fluoreszenzsignal, das im Larvenkörper ungleichmäßig verteilt war. Von einer Region innerhalb der Larven am hinteren Ende wurde ein kohärentes helles Signal ausgesendet, das wir, basierend auf morphologischen Beschreibungen von Kirchgäßner et al. [21], dem Mitteldarm der Würmer zuordnen. Ohne Resazurin inkubierte Larven zeigten bei λex = 555 nm keine Autofluoreszenz (Abb. 4b).

Resorufin-Lokalisierung in A. suum L3. a Versuchsaufbau zur Lokalisierung von Resorufin im Inneren lebender Larven mittels Fluoreszenzmikroskopie. b Kontrolllarven, inkubiert ohne Resazurin. c Bildaufnahme 3 h nach Zugabe von 7,5 µg/ml Resazurin. Hellfeld- (links), Fluoreszenz- (Mitte) und Überlagerungsbilder (rechts) von Resorufin im offenen L3. Eine vergrößerte Ansicht des hinteren und vorderen Endes einer nicht fluoreszierenden Larve mit Darstellung der L2-Kutikula um L3 (schwarze Pfeilspitzen). Bildaufnahmeeinstellungen: λex = 555 nm mit einem Bandpassfilter für λem = 579–604 nm. Schwarzer Maßstabsbalken: 100 µm, gelber Maßstabsbalken: 40 µm, weißer Maßstabsbalken: 20 µm

Einige Larven zeigten keine Fluoreszenzsignale, obwohl sie während des gesamten Tests vital und beweglich wirkten (Abb. 4c). Eine weitere Analyse des nicht fluoreszierenden L3 ergab eine transparente, lockere Hülle, die sowohl am vorderen als auch am hinteren Larvenende sichtbar war (Abb. 4c, schwarze Pfeilspitzen). Wir kommen daher zu dem Schluss, dass die Hülle, die Geenen et al. [11] wird als Cuticula des L2 bezeichnet und bleibt gelegentlich nach der zweiten Häutung sowie nach mechanischem Schlüpfen zurück und verhindert die Aufnahme von Resazurin durch lebensfähiges A. suum L3.

Das pharyngeale Pumpen von geschlüpftem A. suum L3 wurde durch Inkubation der Larven mit FITC-BSA verifiziert. Fluoreszenz wurde am vorderen Ende und hauptsächlich im Darm bei Larven ohne Scheide beobachtet, was auf eine Lokalisierung im Darm hinweist. Umhüllte Larven zeigten keine Fluoreszenz (Zusatzdatei 1: Abb. S1).

Naidoo et al. [27] haben gezeigt, dass eine vorübergehende Exposition lebensfähiger A. suum-Eier bei 60 °C für verschiedene Zeiträume zu einer allmählichen Abnahme der Lebensfähigkeit der Eier führt, die anhand der Morphologie und Motilität beurteilt wurde. Darüber hinaus wurde über eine Methanol-induzierte Fresshemmung mit allmählichen Auswirkungen bei Konzentrationen von 1 bis 5 % [18, 42] und einer tödlichen Wirkung bei Methanolkonzentrationen ab 50 % bei C. elegans berichtet [8]. Daher setzten wir A. suum L3 über unterschiedliche Zeiträume hinweg Hitze (Abb. 5a) und Methanol in unterschiedlichen Konzentrationen (Abb. 5b) aus, um die Fähigkeit des Resazurin-Reduktionstests zu testen, unterschiedliche Schädigungsgrade der Larven festzustellen. Wir beobachteten, dass eine Behandlung bei 60 °C für mehr als 3 Minuten die Stoffwechselaktivität von A. suum L3 signifikant um mehr als 93 % reduzierte (Dunnett-Test, df = 12, 3 Minuten: q = 11,16, 5 Minuten: q = 15,48, 8). min: q = 16,22, P ≤ 0,0001). Kürzere Behandlungszeiten (2 Minuten) führten zu einer Reduzierung um 50 % (Dunnett-Test, df = 12, q = 4,226, P ≤ 0,01), während eine 1-minütige Behandlung bei 60 °C keine Veränderungen in der Stoffwechselaktivität von A hervorrief. Suum L3 (Dunnett-Test, df = 12, q = 0,055, P > 0,99). Bei Larven, die 24 Stunden lang mit 1,5 Vol.-% Methanol behandelt wurden, wurde kein signifikanter Einfluss auf die Resazurin-Reduktionsaktivität festgestellt. Bei Konzentrationen von 3 %, 6 % und 12 % wurde jedoch eine allmähliche Beeinträchtigung der Resazurin-Reduktionsaktivität beobachtet, was zu deutlich schwächeren Fluoreszenzsignalen um 20 % (P ≤ 0,05), 45 % (P ≤ 0,0001) und 70 % führte ( P ≤ 0,0001). Methanol in einer Konzentration von 25 % hob die Resazurin-Reduktion vollständig auf. In der Kontrolle veränderte Methanol selbst in Konzentrationen von 25 % die Fluoreszenzeigenschaften von Resorufin nicht wesentlich (Zusatzdatei 2: Abb. S2). Mit zunehmender Methanolkonzentration wurde ein allmählicher Rückgang der Resorufinproduktion gemessen. Die logistische Regression mit vier Parametern ergab eine halbmaximale effektive Konzentration (EC50) = 6,8 % (df = 26, R2 = 0,95, 95 % KI für EC50 = 4,3–9,2 %) für Methanol (Zusatzdatei 3: Abb. S3). Insgesamt beobachteten wir für A. suum L3, das über längere Zeit 60 °C oder steigenden Methanolkonzentrationen ausgesetzt war, eine allmählich messbare Abnahme der Resazurin-Reduktionsaktivität in den Larven.

Der Resazurin-Reduktionstest ermöglicht die Quantifizierung von Stoffwechselstörungen. Die metabolische Aktivität wurde für A. suum-Larven nach einer Hitzebehandlung bei 60 °C für 0 bis 8 Minuten und einer Exposition gegenüber verschiedenen Methanolkonzentrationen für 3 Stunden mithilfe des Resazurin-Reduktionstests bewertet. Streudiagramme stellen mittlere (SD) Fluoreszenzmessungen von n = 3 technischen Replikaten pro Behandlung dar. Sternchen geben die statistische Signifikanz des Dunnett-Tests an: *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,0001; ns: statistisch nicht signifikant

Wir haben den Resazurin-Reduktionstest weiter im Hinblick auf seine Fähigkeit untersucht, die Auswirkungen einer Anthelminthika-Exposition in vitro auf geschlüpfte A. suum L3 zu bestimmen. Da DMSO als Arzneimittellösungsmittel verwendet wurde und Berichten zufolge bereits bei geringen Konzentrationen von 1–8 Vol.-% DMSO die Lebensfähigkeit von Säugetierzellen beeinflusst [9], haben wir zunächst die Auswirkungen von DMSO auf den L3-Metabolismus von A. suum untersucht.

Bei DMSO-Konzentrationen von 0,5 % und 1 % wurde der Metabolismus der Larven beim Vergleich der mittleren Fluoreszenzintensitäten behandelter und unbehandelter Larven unter Verwendung des Dunnett-Mehrfachvergleichstests nicht signifikant beeinflusst. Allerdings verringerte sich die mittlere Fluoreszenzintensität um 19,5 % für 0,5 % (df = 10, q = 2,328, P = 0,124) und um 17,2 % für 1 % (df = 10, q = 2,05, P = 0,1907) DMSO. Eine DMSO-Konzentration von 2 % führte zu einer signifikanten Verringerung der Stoffwechselaktivität der Larven um 26 % (df = 10, q = 3,163, P = 0,032), während Expositionen von bis zu 4 % DMSO zu einer Immobilisierung der Larven und einer Verringerung um 58 % führten ( df = 10, q = 6,971, P = 0,0002) der Resazurin-Reduktionsaktivität. Um den Einfluss von DMSO auf den Larvenstoffwechsel zu verringern, haben wir für die folgenden Anthelminthika-Arzneimitteltests eine DMSO-Konzentration von 0,5 % in Betracht gezogen.

Bei allen drei Anthelminthika wurde in unterschiedlichen Konzentrationen eine signifikante Verringerung der Stoffwechselaktivität der Larven beobachtet. Die Exposition der Larven gegenüber 1 µM Thiabendazol führte zu einer nicht signifikanten Abnahme der Resazurin-Reduktionsaktivität um 22,7 % (Dunnett-Test, df = 8, q = 2,207, P = 0,1354). Thiabendazol reduzierte in Konzentrationen von 10 µM und 100 µM die Resazurin-Reduktionsaktivität der Larven signifikant um 70 % (Dunnett-Test, df = 8, q = 6,771, P = 0,0004) bzw. 89 % (Dunnett-Test, df = 8, q = 8,647, P). < 0,0001) im Vergleich zur unbehandelten Gruppe. Mebendazol bei 5 µM und Ivermectin bei 0,625 µM reduzierten die Larvenreduktionsaktivität signifikant um 73 % (t-Test, t = 9, df = 4, P < 0,0006) und 55 % (t-Test, t = 11,66, df = 4). P < 0,003).

In der vorliegenden Studie haben wir das Potenzial des Resazurin-Reduktionstests zur Messung der Stoffwechselaktivität in A. suum L3 bewertet. Da die intrazelluläre Resazurin-Reduktion von der Aktivität der Diaphorase-Enzyme abhängt [32], wird sie häufig als Indikator für Lebensfähigkeits-, Proliferations- und Toxizitätstests verwendet [2, 29, 31, 52]. In einigen Studien wurde über Versuche berichtet, den Redoxindikator Resazurin für das Arzneimittelscreening bei Helminthen einzusetzen, darunter Schistosoma-Arten [25, 26], T. muris [39] und Ancylostoma ceylanicum [43]. Nach unserem besten Wissen liegen jedoch Daten zur Bewertung des Resazurin-Reduktionstests für A. spp. vor. L3 fehlt, obwohl es wie Trichuris spp. zu den weltweit am weitesten verbreiteten STH gehört, die Menschen und Tiere gleichermaßen betreffen [15, 51].

Unsere Ergebnisse zeigen, dass Resazurin in A. suum-Larven zum fluoreszierenden Resorufin reduziert wird. Die Resorufinproduktion ist direkt proportional zur Anzahl von A. suum L3, was auch für Schistosomula beschrieben wurde [26]. Wir beobachteten, dass mit steigender Resazurin-Konzentration eine hyperbolische Sättigung der Fluoreszenzintensität auftritt, was auf eine enzymvermittelte Reduktion von Resazurin durch intrazelluläre Diaphoraseenzyme hinweist [32, 48]. Eine Resazurin-induzierte Toxizität bei 7,5 µg/ml kann wahrscheinlich ausgeschlossen werden, da Konzentrationen von bis zu 12,5 µg/ml als nicht toxisch für Säugetierzellen gelten [23]. Wir beobachteten jedoch eine verminderte Motilität in A. suum L3 bei Resazurin-Konzentrationen über 15 µg/ml, was weiterer Untersuchungen bedarf.

Darüber hinaus wollten wir die Stelle lokalisieren, an der Resazurin durch den Parasiten zu Resorufin reduziert wird. Wir haben die Möglichkeit einer Resazurin-Reduktion entweder durch Ausscheidungs-/Sekretionsprodukte (ES) oder den Inhalt extrazellulärer Vesikel in Betracht gezogen. ES-haltiger Überstand von A. suum L3-Kulturen, die mit Resazurin inkubiert wurden, zeigte keinen konzentrationsabhängigen Anstieg der Fluoreszenzintensität, was die Möglichkeit einer Resazurin-Reduktion durch ES-Produkte oder extrazelluläre Vesikelinhalte berücksichtigt, von denen berichtet wurde, dass sie Stoffwechselenzyme enthalten [13, 45]. Basierend auf den Beobachtungen der Einschränkung der FITC-BSA-Aufnahme in umhülltem A. suum L3 (Zusatzdatei 1: Abb. S1) und der räumlichen Überlappung der Fluoreszenzsignale von L3, das mit FITC-BSA oder Resazurin inkubiert wurde, gehen wir davon aus, dass Resazurin durch aufgenommen wird die orale Öffnung von Larven ohne Hülle und nicht durch die Cuticula und Epidermis. Darüber hinaus könnte das Vorhandensein umhüllter Larven die Auswertung von Arzneimittel-Screening-Assays beeinflussen, insbesondere wenn der Fokus nur auf Motilitätsmessungen liegt, da die Kutikula die Arzneimittelaufnahme beeinflussen kann. Basierend auf dieser Beobachtung und ähnlichen Berichten über L3 von Ancylostoma caninum und Heligmosomoides polygyrus [6, 7] schlagen wir vor, die Häufigkeit von Larven ohne Hülle nach dem Schlüpfen sorgfältig zu untersuchen, um eine mögliche Verzerrung für A. suum L3-In-vitro-Tests zu verringern. Alternativ könnte es möglich sein, die Daten vor dem Vergleich zwischen verschiedenen Chargen auf den Mittelwert der Vehikelkontrollen zu normieren, die innerhalb derselben Larvencharge erhalten wurden.

Hitzebehandeltes A. suum L3 produzierte in unserer Studie mit zunehmender Hitzeeinwirkungsdauer allmählich weniger Resorufin, vermutlich aufgrund einer hitzebedingten Beeinträchtigung der Stoffwechselaktivität der Larven. Wir beobachteten eine vollständige Inaktivierung des Stoffwechsels bei Larven, die länger als 3 Minuten behandelt wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden von Naidoo et al. berichtet. [27, 28], die nach 3-minütiger Einwirkung von 60 °C eine Inaktivierung der Lebensfähigkeit der Eier und sichtbare Schäden an den Eiern beobachteten. Darüber hinaus haben wir den Einfluss von Methanol auf A. suum L3 für Konzentrationen bis zu 25 Vol.-% mithilfe des Resazurin-Reduktionstests bewertet. In Übereinstimmung mit den Beobachtungen von Jones und Candido [18] zeigen unsere Ergebnisse eine allmählich zunehmende toxische Wirkung auf die Stoffwechselaktivität der Larven bei Methanolkonzentrationen von 3 bis 12 % und eine nahezu vollständige Stoffwechselinaktivierung bei 25 %. Unsere Ergebnisse zeigen jedoch, dass A. suum L3 anfälliger für Methanol ist als C. elegans, da der gemeldete 24-Stunden-LC50-Wert von 12 % für C. elegans doppelt so hoch ist wie für A. suum L3 mit 6,8 % Methanol ( Zusatzdatei 3: Abb. S3). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Resazurin-Reduktionstest zur Messung der Stoffwechselaktivität von A. suum L3 verwendet werden kann und dabei hilft, subtile Veränderungen des Stoffwechsels zu erkennen, wenn physikalischer oder chemischer Stress ausgeübt wird. Da der Assay jedoch das Gesamtreduktionspotenzial von 100 oder mehr Larven misst, muss noch untersucht werden, ob der beobachtete Fluoreszenzabfall auf eine Subpopulation toter Larven oder eine Stoffwechselstörung der gesamten anfänglichen Larvenpopulation nach dem angewendeten Stress zurückzuführen ist. Darüber hinaus sollte darauf geachtet werden, dass das zu testende Mittel keine stark reduzierenden Eigenschaften aufweist und den pH-Wert des verwendeten Mediums nicht verändert, um eine Übersättigung des Fluoreszenzsignals und/oder Fehlmessungen zu vermeiden (Abb. 6).

Resazurin-Reduktionstest bei Drogentests. Nach einer 24-stündigen Inkubation mit 7,5 µg/ml Resazurin wurden die Larven 24 Stunden lang Anthelminthika ausgesetzt. Die relativen Fluoreszenzintensitäten wurden für mit DMSO behandelte Larven von 0 bis 4 Vol.-% fluormetrisch gemessen. b Thiabendazol in 0,5 % DMSO, angewendet von 0 bis 100 µM. c Ivermectin in 0,5 % DMSO, angewendet bei 625 nM. d Mebendazol in 0,5 % DMSO, angewendet bei 5 µM. Streudiagramme stellen die mittlere Fluoreszenzintensität (λex = 540, λem = 590) für n = 3 technische Replikate dar. Sternchen geben die statistische Signifikanz des Dunnett-Tests für DMSO und Thiabendazol und des t-Tests für Ivermectin und Mebendazol an: *P ≤ 0,05, ***P ≤ 0,001, ****P ≤ 0,0001; ns: statistisch nicht signifikant. Alle Arzneimitteltests wurden unabhängig voneinander mit in vitro geschlüpften A. suum L3 aus verschiedenen Chargen wiederholt

Darüber hinaus haben wir den Resazurin-Reduktionstest auf seine Fähigkeit untersucht, die Wirkung von Anthelminthika bei A. suum L3 zu beurteilen. Wir haben Ivermectin, Mebendazol und Thiabendazol getestet, prominente Beispiele der makrozyklischen Lacton- und Benzimidazol-Arzneimittelklassen, die hauptsächlich für die anthelmintische Chemotherapie verwendet werden und wirksam gegen Askariasis bei Menschen und Schweinen sind [4, 5, 41, 46]. Da diese Anthelminthika in wässrigen Lösungen nur sehr schlechte Löslichkeitseigenschaften aufweisen, wird meist DMSO zugesetzt, um die Löslichkeit zu erhöhen. Allerdings wurden toxische Wirkungen von DMSO für 2 bis 4 % auf Säugetierzellen berichtet [9]. Daher untersuchten wir den Einfluss von DMSO für Volumenkonzentrationen bis zu 4 % und stellten fest, dass die Grenze der DMSO-Konzentrationen, die den Larvenstoffwechsel nicht signifikant beeinflussen, bei 0,5–1 % liegt. Die In-vitro-Wirkung von Ivermectin auf A. suum-Larven wurde zuvor mithilfe von Motilitäts- und Migrationstests bewertet (14, 16). Hu et al. [16] berichteten für Ivermectin über einen hohen IC50-Wert von > 1,14 mM in A. suum L4 (Darm-Isolate 14 Tage nach der Infektion). Allerdings konnten wir eine Ivermectin-Konzentration von 1,14 mM ohne Ausfällung des Arzneimittels in 0,5 % DMSO nicht reproduzieren. Daher haben wir Ivermectin in 0,5 % DMSO (in H2O) titriert und turbidimetrisch seine maximale Löslichkeit bei 1,56 µM in H2O nachgewiesen (Zusatzdatei 4: Tabelle S1). Darüber hinaus war die Löslichkeit von Ivermectin in HBSS-AB aufgrund von Medienbestandteilen wie Salzen, Zucker und Antibiotika geringer, wodurch die maximale lösliche Konzentration auf 625 nM sank. Bei dieser Ivermectin-Konzentration beobachteten wir eine 55-prozentige Verringerung der Aktivität der Resazurin-Reduktion in L3, was folglich auf einen erheblich niedrigeren EC50-Wert für A. suum L3 als für A. suum L4 hinweist, der von Hu et al. beobachtet wurde. [16]. Hansen et al. [14] berichteten für Ivermectin über einen IC50 von ~ 1 µM in A. suum L3, was unseren Beobachtungen näher kommt. Für C. elegans wurden jedoch signifikante Effekte bei deutlich niedrigeren Ivermectin-Konzentrationen (0,6–20 nM Ivermectin) beobachtet [3, 12]. Dies könnte einerseits darauf hindeuten, dass der Resazurin-Reduktionstest im Vergleich zu In-vitro-Tests bei anderen Nematoden weniger empfindlich für den Nachweis der Auswirkungen von Ivermectin auf A. suum L3 ist. Andererseits, zusammen mit den Beobachtungen von Hu et al. [16] und Hansen et al. [14] ist es denkbar, dass A. suum-Larven weniger anfällig für Ivermectin sind als C. elegans-Larven. Die Auswirkungen von Thiabendazol und Mebendazol auf A. suum L3 wurden bisher von Zhao et al. untersucht. [50], die EC50-Werte im Bereich von 2,3–150 nM unter Verwendung eines Agar-Migrationstests zur Bewertung der Arzneimittelwirkung nach 24-stündiger Arzneimittelbehandlung berichteten. Allerdings führten 1000-fach höhere Konzentrationen dieser Anthelminthika in der vorliegenden Studie zu einer signifikanten, aber nicht vollständigen Inaktivierung der Resazurin-Reduktionsaktivität um 73 % bis 89 %. Der direkte Vergleich der Studien ist schwierig, da die Arzneimittelwirkungen mit unterschiedlichen Methoden bewertet wurden. Allerdings ist der Resazurin-Reduktionstest möglicherweise weniger empfindlich bei der Erkennung von Beeinträchtigungen der Fortbewegung der Larven als der Agar-Migrationstest, bietet aber möglicherweise eine bessere Empfindlichkeit bei der Erkennung von Beeinträchtigungen der Stoffwechselaktivität der Larven.

Die Embryonierungsraten von A. suum-Eiern können von Charge zu Charge variieren, was zu einer heterogenen Eilösung führt, die unfruchtbare, nicht embryonierte und vollständig embryonierte Eier umfasst [10, 33]. Wenn teilweise entwickelte Larven in der Endpopulation verbleiben, könnte dies die Arzneimittelscreening-Ergebnisse von Motilitäts-, Migrations- oder Stoffwechselaktivitätstests verfälschen. Daher ist die Synchronisierung eines bestimmten Larvenentwicklungsstadiums eine Lösung zur Minimierung der Variabilität jedes Tests mit Nematodenlarven, wie für den frei lebenden Nematoden C. elegans beschrieben [36]. Nach unserem Kenntnisstand wurden solche Ansätze bei A. suum L3 jedoch nicht untersucht. Mithilfe eines diskontinuierlichen, mehrschichtigen Saccharose-Dichtegradienten haben wir Eier unterschiedlicher Entwicklungsstadien aus einer heterogenen Eilösung getrennt und angereichert. Interessanterweise zeigten vollständig embryonierte Eier, die aus Schichten mit 23 % und 25 % Saccharose gewonnen wurden, eine ähnliche und typische Morphologie von L3 (44). Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um mögliche Unterschiede zwischen diesen beiden Dichtetypen von Eiern zu untersuchen.

Zusammenfassend wurde in dieser Studie der Resazurin-Reduktionstest zur Quantifizierung der Stoffwechselaktivität in A. suum L3 etabliert und zum ersten Mal ein unkomplizierter Ansatz zur Anreicherung vollständig embryonierter A. suum-Eier demonstriert. Mit dem Resazurin-Reduktionstest können allmähliche Stoffwechselveränderungen von A. suum L3 nach Exposition gegenüber physikalischen und chemischen Stressfaktoren, einschließlich wichtiger Anthelminthika, nachgewiesen werden. Der Assay ist kostengünstig und einfach und kann bei richtiger Anwendung ein Arzneimittelscreening mit mittlerem Durchsatz ermöglichen. Darüber hinaus kann es Einblicke in die allgemeine Stoffwechselaktivität der Larven geben. Der Resazurin-Reduktionstest bietet ein hervorragendes Potenzial zur Ergänzung verfügbarer Tests für das Screening auf Arzneimittelwirkungen und hat insbesondere den Vorteil, eine potenzielle Ausleseverzerrung zu reduzieren und einfachere kombinatorische Screening-Ansätze für mutmaßliche Anthelminthika voranzutreiben, was letztendlich die Entdeckung von Anthelminthika-Arzneimitteln beschleunigen kann.

Alle Daten, die die Schlussfolgerungen dieses Artikels stützen, sind im Artikel und seinen zusätzlichen Dateien enthalten.

Rinderserumalbumin

Destilliertes Wasser

Ausscheidend/sekretorisch

Fluoresceindiacetat

Fluorescein-konjugiertes Rinderserumalbumin

Hanks ausgewogene Salzlösung, ergänzt mit Antibiotika

Larven im dritten Stadium

Larven im vierten Stadium

3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid

para-Nitrophenylphosphat

Durch den Boden übertragener Helminth

Volumenkonzentration

Massenkonzentration

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Wir danken Beate Anders, Christiane Palissa, Bettina Sonnenburg und Yvonne Weber vom Institut für Immunologie (Freie Universität Berlin, Berlin, Deutschland) für die Sammlung erwachsener Würmer und Eier, methodischer Unterstützung und technischer Hilfe sowie Anne Winkler (Institut für Immunologie, Freie Universität Berlin, Deutschland) für die Sammlung erwachsener Würmer und Eier, für methodische Unterstützung und technische Unterstützung Universität Berlin, Berlin, Deutschland) für grafische Unterstützung.

Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) für die Förderung im Rahmen der Projekte GRK 2046: Parasiteninfektionen: Von experimentellen Modellen zu natürlichen Systemen (Projektnummer 251133687) an FE, SH und JK.

Institute of Immunology, Department of Veterinary Medicine, Freie Universität Berlin, Berlin, Germany

Arkadi Kundik, Zaneta D. Money, Susanne Hartmann & Friederike Ebner

Institut für Parasitologie und Tropenveterinärmedizin, Fachbereich Veterinärmedizin, Freie Universität Berlin, Berlin, Deutschland

Jürgen Krücken

Leibniz-Institut für Zoo- und Wildtierforschung, Berlin, Deutschland

Thomas Hildebrandt

Max-Born-Institut, Berlin, Deutschland

Oleg Kornilow

Lehrstuhl für Infektionspathogenese, Abteilung für Molekulare Lebenswissenschaften, Fakultät für Lebenswissenschaften, Technische Universität München, München, Deutschland

Friederike Ebner

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Konzeptualisierung: AK, FE und SH; Methodik: AK, FE, SH, JK, TH und OK; Validierung: AK; formale Analyse: AK; Untersuchung: AK, ZDM; Ressourcen: SH; Datenkuration: AK; Verfassen von Manuskripten: AK, Überprüfung und Bearbeitung von Manuskripten: AK, FE, SH, JK, TH, OK, ZDM; Visualisierung: AK; Betreuung: FE, SH, TH, OK; Fördermittelakquise: FE, SH, TH, OK.

Korrespondenz mit Friederike Ebner.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Unbehüllte A. suum L3 nehmen Fluorescein-konjugiertes Rinderserumalbumin (FITC-BSA) auf. Starke Fluoreszenz zeigt sich im Mitteldarm (links) und in der Mundöffnung (rechts). b L3, das eine intakte Hülle trägt (links, durch schwarze Pfeilspitze angezeigt), zeigt keine Fluoreszenz (rechts). Bildaufnahmeeinstellungen: λex = 475 nm mit einem Bandpassfilter für λem = 500–525 nm. Weißmaßstab: 20 µm. Gelber Maßstabsbalken: 40 µm.

Fluoreszenzemissionsspektren von Resorufin verdünnt in H2O und 25 % Methanol (MeOH) bei 540 nm. Die gestrichelte schwarze Kurve (Peak bei 585 nm) stellt das gemessene Emissionsspektrum von in H2O verdünntem Resorufin dar, und die durchgezogene schwarze Kurve (Peak bei 587 nm) stellt das gemessene Emissionsspektrum von in 25 % MeOH verdünntem Resorufin dar.

Einfluss von Methanol (MeOH) auf die Stoffwechselaktivität von A. suum L3. Larven (500 L3/96-Well) wurden 3 Stunden lang unterschiedlichen Konzentrationen (v/v) MeOH ausgesetzt und die relative Fluoreszenzintensität von Resorufin wurde nach 24-stündiger Inkubation mit 7,5 µg/ml Resazurin gemessen. Eine logistische Vier-Parameter-Regressionsanalyse der log10-transformierten MeOH-Konzentration wurde verwendet, um die Dosis-Wirkungs-Kurve zu interpolieren (durchgezogene schwarze Linie; df = 26, R2 = 0,95). Best-Fit EC50 = 6,8 % (95 %-KI = 4,3–9,2 %). Schwarze Punkte stellen arithmetische Mittelwerte dar und Whiskers entsprechen der Standardabweichung von n = 3 technischen Replikaten. Koordinaten, dargestellt mit einer logarithmischen Basis-2-Skala auf der x-Achse und einer linearen Skala auf der y-Achse.

Maximale lösliche Konzentrationen von Ivermectin, Mebendazol und Thiabendazol in 0,5 % DMSO, bestimmt durch turbidimetrischen Löslichkeitstest.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kundik, A., Investor, ZD, Krücken, J. et al. Quantifizierung der Stoffwechselaktivität von Ascaris suum L3 mittels Resazurin-Reduktion. Parasite Vectors 16, 243 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05871-5

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Eingegangen: 25. Januar 2023

Angenommen: 04. Juli 2023

Veröffentlicht: 19. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05871-5

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