Bewertung von cpn60 für hoch

ISME Communications Band 3, Artikelnummer: 69 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Obwohl das 16S-rRNA-Gen der am weitesten verbreitete phylogenetische Marker für die Amplikon-basierte Profilierung mikrobieller Gemeinschaften ist, schränkt seine begrenzte phylogenetische Auflösung seine Verwendung für Studien zur Wirt-Mikroben-Koevolution ein. Im Gegensatz dazu ist das cpn60-Gen ein universeller phylogenetischer Marker mit größerer Sequenzvariation, der eine Auflösung auf Artenebene ermöglicht. Diese Forschung verglich mikrobielle Profile der Haut von Säugetieren, die aus cpn60- und 16S-rRNA-Gensequenzierungsansätzen generiert wurden, und testete Muster der Phylosymbiose, die auf koevolutionäre Wirt-Mikroben-Assoziationen schließen lassen. Ein ca. 560 bp großes Fragment des cpn60-Gens wurde mit Universalprimern amplifiziert und einer Hochdurchsatzsequenzierung unterzogen. Die taxonomische Klassifizierung von cpn60-Sequenzen wurde mithilfe eines für dieses Projekt erstellten naiv-bayesianischen QIIME2-Klassifikators durchgeführt, der mit einer durch NCBI ergänzten kuratierten cpn60-Datenbank (cpnDB_nr) trainiert wurde. Der cpn60-Datensatz wurde dann mit veröffentlichten 16S-rRNA-Gen-Amplikondaten verglichen. Beta-Diversitätsvergleiche mikrobieller Gemeinschaftsprofile, die mit cpn60- und 16S-rRNA-Genamplikons erstellt wurden, unterschieden sich nicht signifikant, basierend auf der Procrustes-Analyse der Bray-Curtis- und UniFrac-Abstände. Trotz ähnlicher Beziehungen zwischen mikrobiellen Hautprofilen ermöglichte die verbesserte phylogenetische Auflösung durch die cpn60-Gensequenzierung Beobachtungen von Phylosymbiose zwischen mikrobiellen Gemeinschaftsprofilen und ihren Säugetierwirten, die zuvor mit 16S-rRNA-Genprofilen nicht beobachtet wurden. Nachfolgende Untersuchungen von Staphylococcaceae-Taxa unter Verwendung des cpn60-Gens zeigten im Vergleich zu den 16S-rRNA-Genprofilen eine erhöhte phylogenetische Auflösung, was mögliche koevolutionäre Wirt-Mikroben-Assoziationen aufdeckte. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass 16S-rRNA- und cpn60-Markergene vergleichbare Zusammensetzungsmuster der mikrobiellen Gemeinschaft erzeugen, während cpn60 Analysen wie Phylosymbiose, die eine erhöhte phylogenetische Auflösung erfordern, besser erleichtert.

Mikrobengemeinschaften der Haut von Säugetieren haben einen direkten Einfluss auf die Gesundheit und Krankheit des Wirts und teilen eine lange Evolutionsgeschichte mit ihren jeweiligen Wirten. Es wird angenommen, dass anfängliche räuberische und ernährungsbedingte Wechselwirkungen zwischen den Vorfahren moderner Bakterien und Eukaryoten zur Mehrzelligkeit geführt haben [1], die sich dann zu komplexen Stoffwechselsymbiosen [2] und angeborenen Immunantworten von Wirbeltieren entwickelte [3, 4]. Angesichts der Unterschiede in der Physiologie [5], der Haar- und Fellbedeckung [5, 6], der geografischen Herkunft und den Lebensraummerkmalen [7] sowie der Evolutionsgeschichte und Verwandtschaft [8] fördert die Hautumgebung von Säugetieren Fälle wirtsspezifischer mikrobieller Koevolution . Aufgrund der Nischenheterogenität, die durch Säugetierwirte vermittelt wird, geht man davon aus, dass der Aufbau mikrobieller Hautgemeinschaften deterministisch (d. h. von bestimmten Umwelt- oder Wirtsfaktoren beeinflusst) und nicht stochastisch (d. h. zufälliger Aufbau und Geburts-Tod-Ereignisse) ist [9]. Für bestimmte Säugetierordnungen zeigen mikrobielle Beweise, dass die Phylogenie des Wirts mit der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft korreliert, was sich als „Phylosymbiose“ manifestiert [8].

Phylosymbiose ist ein Muster, bei dem die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft eines Wirts die Umwelt- und phylogenetische Geschichte des Wirts widerspiegelt [10,11,12], wobei weiter entfernt verwandte Wirtsarten größere Unterschiede in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft aufweisen als diejenigen, die näher verwandt sind [8]. ]. Der anfängliche Aufbau einer mikrobiellen Gemeinschaft durch stochastische oder deterministische Prozesse könnte im Laufe der Zeit enge Interaktionen zwischen dem Wirt und den damit verbundenen Mikrobiota fördern, was möglicherweise zu koevolutionären Beziehungen und verstärkten Assoziationen führt [12]. Unter Verwendung des phylogenetischen Markers des 16S-rRNA-Gens haben Ross et al. zeigten erste Hinweise auf eine Phylosymbiose innerhalb der Ordnungen Perissodactyla und Artiodactyla, bei denen es sich um Unpaarhufer bzw. Paarhufer handelt [8]. Ihre Studie identifizierte auch ein Kernmikrobiom, das allen untersuchten Ordnungen gemeinsam ist und unter anderem durch bodenassoziierte Bakterien wie Agrobacterium und Arthrobacter sowie durch Taxa der häufigen Hautbakteriengattung Staphylococcus repräsentiert wird [8, 13, 14]. Bei Primaten wurde ein zentrales axilläres Mikrobiom, das Staphylokokken enthält, als dominanter Faktor für die mikrobielle Beta-Diversität identifiziert [5].

Mikrobiomstudien, wie die oben erwähnten, verwenden aufgrund der mit der vollständigen 16S-rRNA-Gensequenzierung und Metagenomik verbundenen Kosten am häufigsten die Short-Read-Amplikon-16S-rRNA-Gensequenzierung. Allerdings führt die begrenzte phylogenetische „Auflösung“ des 16S-rRNA-Gens bei Verwendung für Short-Read-Sequenzierung zu einer Sequenzklassifizierung meist auf Gattungsebene [15], was detaillierte Untersuchungen mikrobieller Arten und spezifischer Populationen wie Staphylococcaceae verhindert. Diese Einschränkung der phylogenetischen Auflösung kann auch Beobachtungen einer Phylosymbiose verschleiern, die möglicherweise nur auf niedrigeren taxonomischen Ebenen auftritt. Die Untersuchung des Hautmikrobioms von Säugetieren unter Verwendung alternativer Genmarker mit höherer phylogenetischer Auflösung, wie z. B. cpn60 [16], könnte wichtige Mikroben-Wirt-Assoziationen aufdecken, die auf bestehende oder potenzielle zukünftige koevolutionäre Beziehungen innerhalb der Klasse Mammalia hinweisen könnten, mit Auswirkungen auf die Hautgesundheit von Säugetieren und Krankheit.

Mehrere Merkmale des cpn60-Gens, auch bekannt als hsp60 und groEL, machen es nützlich für kurzzeitige Profilierungsstudien zur Amplikon-Mikrobengemeinschaft. Das cpn60-Gen ist universell und kodiert für ein 60 kDa großes GroEL-Protein, das zu einer Familie von Typ-I-Chaperoninen gehört, die in Bakterien und Chloroplasten vorkommen, wobei äquivalente Typ-II-Chaperonine in Archaeen und Eukaryoten vorkommen. Wie beim 16S-rRNA-Gen ist das Vorhandensein von cpn60 und die Funktion von GroEL für das Überleben der Zelle essentiell und daher in allem prokaryotischen Leben vorhanden [17]. Im Gegensatz zum 16S-rRNA-Gen ist jedoch in den meisten prokaryotischen Genomen nur eine einzige Kopie von cpn60 vorhanden [16]. Darüber hinaus enthält das cpn60-Gen eine viel größere Sequenzdiversität im Vergleich zu den variablen Regionen des 16S-rRNA-Gens, die in Short-Read-Amplikonstudien verwendet werden, mit einer höheren Diversität in der Nukleotididentität und größeren Unterschieden in der Sequenzähnlichkeit zwischen den Arten [16]. Darüber hinaus erzeugen die Primer, die zur Amplifikation der 274–828 „universellen Zielregion“ des cpn60-Gens [16] verwendet werden, ein Amplifikat mit einer Länge von ~554 bp. Obwohl diese Länge die aktuelle Short-Read-Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie übersteigt, sind nur 150–250 Basen des Vorwärts-Reads erforderlich, um ausreichende Daten für die phylogenetische Klassifizierung auf Artenebene zu erzeugen [18], sodass sie auf aktuellen Sequenzierungsplattformen verwendet werden können ( z. B. MiSeq, Illumina). Darüber hinaus zeigte die kürzlich durchgeführte Validierung der naiv-bayesianischen Klassifizierung mithilfe des RDP-Klassifikators einen hohen Grad an Klassifizierung auf Artenebene mithilfe von cpn60-Referenzsequenzen [19]. Aufgrund der intrinsischen Merkmale des cpn60-Gens, der kontinuierlichen Entwicklung von Primern [20, 21] und Referenzdatenbanken [22], der vorherigen In-silico- und In-situ-Validierung [16, 18, 19] und der Geschichte der universellen und gezielten Verwendung In Studien zur mikrobiellen Profilierung [23,24,25,26,27,28,29] ist das cpn60-Gen eine leistungsstarke Ergänzung zum 16S-rRNA-Gen als universeller phylogenetischer Marker im Kontext der Profilierung mikrobieller Gemeinschaften und der Phylosymbiose-/Koevolutionsforschung des Hautmikrobioms.

Durch die Nutzung der erhöhten phylogenetischen Auflösung des cpn60-Gens in Kombination mit Amplikonsequenzvarianten (ASVs), die einzelne Amplikonsequenzen identifizieren können (30), können Hautmikrobiota gründlicher profiliert und auf Muster wie Phylosymbiose und Koevolution untersucht werden. Darüber hinaus können Kernmikrobiota, die mit der Haut assoziiert sind, wie z. B. Staphylococcaceae, mit erhöhter phylogenetischer Auflösung profiliert werden, ähnlich wie bei Sequenztypisierungsansätzen mit mehreren oder einzelnen Standorten [31], wodurch eine hohe Spezifität und ein universeller Nachweis von Bakterien ausgeglichen werden. Obwohl in früheren Studien das cpn60-Gen verwendet wurde, um das Mikrobiom der menschlichen Vagina [23, 24, 25] und des Kots von Schweinen [32] zu profilieren, wurde es bereits zur Profilierung des breiteren Mikrobioms der Haut von Säugetieren eingesetzt. Diese Studie verwendet vergleichende mikrobielle Profile von gepaarten cpn60- und 16S-rRNA-Gendatensätzen, um zusätzliche Unterstützung für die Verwendung von cpn60 zur Profilierung von Hautmikrobiota zu liefern, frühere Berichte über Phylosymbiose auf der Haut von Säugetieren zu bestätigen [8] und neue Erkenntnisse über spezifische mikrobielle Populationen der Haut von Säugetieren zu präsentieren ihre potenziellen Interaktionen mit ihren jeweiligen Gastgebern. Diese Studie zeigt außerdem, wie die cpn60-Datenbank cpnDB (22) in die QIIME2-Pipeline für vollständige mikrobielle Sequenzdaten integriert werden kann, um vollständige cpn60-Gen-Amplikon-Datensätze zu erstellen.

Genomische DNA aus Hautabstrichen von Säugetieren wurde im Rahmen einer früheren 16S-rRNA-Genuntersuchung extrahiert, die durch Amplifikation der V3-V4-Region mit den universellen prokaryotischen Pro341F/Pro805R-Primern generiert wurde [8]. Aus diesen wurde eine repräsentative Teilmenge von 95 Proben für die cpn60-basierte Sequenzierung und mikrobielle Profilierung ausgewählt. Sowohl die PCR-Amplifikation als auch die Hochdurchsatzsequenzierung der Proben wurden wie zuvor beschrieben an der Universität von Saskatchewan durchgeführt (20, 21). Das cpn60-Gen wurde durch PCR unter Verwendung eines Primermixes bestehend aus 100 µM M279 (5′ – GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC – 3′), M280 (5′ – YKIYKITCICCRAAICCIGGIGC– 3′), M1612 (5′ – GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC– 3′) und M1613 amplifiziert (5′ – CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT– 3′). Alle Primer enthielten Illumina-Adaptersequenzen am 5'-Ende. Die Primer wurden in einem Molverhältnis von 1:3 aus M279 und M280 (jeweils 3 µL) und M1612 und M1613 (jeweils 9 µL) kombiniert und dann in Reinstwasser auf ein Gesamtvolumen von 300 µL verdünnt. Alle für die PCR und Sequenzierung verwendeten PCR-Röhrchen, Platten und Reinstwasser wurden vor der Verwendung durch 20-minütige Einwirkung von UV-Licht dekontaminiert. Ein PCR-Mastermix wurde unter Verwendung von 38,1 µL UV-behandeltem Reinstwasser, 0,4 µL Invitrogen Platinum Taq (ThermoFisher Scientific), 5 µL 10X Thermopol-Puffer, 1 µL 10 mM dNTPs und 1 µL des 1:3-Primers hergestellt Cocktail für ein Gesamtreaktionsvolumen von 50 µL für 2 µL Vorlage. Die Amplifikationsreaktionsbedingungen waren eine anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 5 Minuten, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 30 Sekunden, Annealing bei 60 °C für 30 Sekunden, Verlängerung bei 72 °C für 30 Sekunden und einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 2 Min. Alle PCR-Amplifikationen wurden zunächst auf einem 1 %igen Ethidiumbromidgel sichtbar gemacht, dann aus dem Gel extrahiert und mit NucleoMag-Perlen (Macherey-Nagel) wie zuvor beschrieben gereinigt [21]. Die gereinigte Amplikonbibliothek wurde unter Verwendung eines 401 × 101-Zyklus unter Verwendung des TG MiSeq Reagent Nano Kit v2 (Illumina Canada, MS-103-1003) auf einem MiSeq-System (Illumina) sequenziert.

Demultiplexte Sequenzen wurden verwendet, um ASVs mit QIIME2 Version 2019.10.0 zu generieren [33, 34]. Nur Vorwärts-Reads, die ein 400 Nukleotide langes Amplikon enthielten, wurden in QIIME2 importiert und mit DADA2 Version 2019.10.0 auf 200 Nukleotide gekürzt [35]. Die getrimmten Lesevorgänge wurden dann vor der ASV-Erzeugung unter Verwendung von DADA2 entrauscht und chimäre Sequenzen entfernt. Ein QIIME2-Naive-Bayes-Taxonomieklassifikator (33, 34) wurde unter Verwendung einer Kombination von Referenzsequenzen aus der cpnDB-Referenzdatenbank (22) und NCBI (36) erstellt. Aus DADA2 erstellte repräsentative Sequenzen wurden mit nBLAST verwendet, um die nicht-redundante, nur kultivierte NCBI-Referenzdatenbank unter Einbeziehung eines E-Wert-Schwellenwerts von 1e-6 unter Verwendung von Entrez Direct abzufragen (37). Die drei besten Ergebnisse für jede Sequenzabfrage wurden gesammelt, um eine Datenbank mit 16.624 Sequenzen zu erstellen. Replikateinträge und Sequenzen unter 180 Nukleotiden wurden entfernt (4400) und die verbleibenden Sequenzen (12.224) wurden mit der cpnDB_nr (5489) kombiniert, um eine endgültige Datenbank mit 17.713 cpn60-Genreferenzsequenzen zu erstellen. Taxonomische Abstammungslinien für die repräsentativen Sequenzen wurden von NCBI unter Verwendung der Referenzsequenz-Zugangsnummern erhalten und anschließend für die Integration in die QIIME2-Umgebung formatiert.

Alle für die aktuelle Studie generierten cpn60-Sequenzen wurden im European Nucleotide Archive (ENA) unter der Projektzugangsnummer PRJEB43503 hinterlegt. Eine cpn60-ASV-Tabelle wurde unter https://figshare.com/articles/dataset/cpn60_ASV_table/14955753 verfügbar gemacht.

Cytochromoxidase I (COXI)-Gene für Kap-Elenantilopen, Esel, Ziegen, Pferde, Olivenpaviane, Przewalski-Pferde, Schafe, Tüpfelhyänen und Sumatra-Orang-Utans wurden aus einer früheren Studie [8] gewonnen und zur Konstruktion eines COXI-basierten Säugetiers verwendet Phylogenie. Die COXI-Gensequenzen von Säugetieren wurden mit ClustalW [38] in MEGA Das optimale Nukleotidsubstitutionsmodell wurde mit JModelTest2 Version 2.1.10 ermittelt [40, 41]. Für das COXI-Gen von Säugetieren wurde ein Maximum-Likelihood-Dendrogramm unter Verwendung von MEGA Anschließend wurde die Phylogenie der Säugetiere mit der Literatur verglichen und auf ihre Richtigkeit hin bestätigt.

Mikrobielle Dendrogramme basierend auf der Zusammensetzung der Gemeinschaft wurden unter Verwendung von 16S-rRNA-Gensequenzen erstellt, die aus einem zuvor generierten Amplikon-Datensatz [8] erhalten wurden, und der cpn60-Gensequenzen aus dieser aktuellen Studie. Für die mikrobiellen Dendrogramme des 16S-rRNA- und cpn60-Gens wurden die jeweiligen ASV-Tabellen auf Basis der Säugetierwirtsproben kollabiert, und die ASV-Lesezahlen wurden für jede Kategorie summiert. Bray-Curtis-, ungewichtete UniFrac- und gewichtete UniFrac-Distanzmatrizen für die ASV-Tabellen wurden mit dem QIIME2-Diversity-Beta-Rarefaction-Befehl generiert, auf 1000 Lesevorgänge verfeinert und zum Erstellen von UPGMA-Dendrogrammen mit einer Konfidenzbewertung von 1000 Bootstraps verwendet.

Um die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft zwischen 16S-rRNA- und cpn60-Gendatensätzen zu vergleichen, wurden Procrustes-Analysen anhand von PCoA-Ordinationen (Principal Coordinate Analysis) durchgeführt, die mithilfe von Bray-Curtis und gewichteten/ungewichteten UniFrac-Metriken generiert wurden. Distanzmatrizen wurden mit dem Befehl qiime2 diversity core-metrics-phylogenetic generiert und dann mit qiime-tools export exportiert. Procrustes-Analysen wurden in R mit dem Paket „vegan“ und dem Befehl „protest“ mit 100.000 Permutationen durchgeführt und mit ggplot grafisch dargestellt.

COXI-Gen- und mikrobielle 16S-rRNA- und cpn60-Gen-Dendrogramme von Säugetieren wurden unter Verwendung der Vegan-, Phangorn- und Affenpakete in R wie zuvor beschrieben verglichen und auf Kongruenz bewertet [8]. Die Phylosymbiose wurde mit Robinson-Foulds-Scores sowohl für das 16S-rRNA- als auch das cpn60-Gen-Dendrogramm im Vergleich zum COXI-Dendrogramm von Säugetieren bewertet. Die Signifikanz der Robinson-Foulds-Metrik wurde durch den Vergleich des COXI-Gen-Dendrogramms von Säugetieren mit 100.000 zufällig generierten Bäumen mit identischen Endknoten (d. h. Taxa) ermittelt. Die Kongruenz zwischen Dendrogrammen wurde mit dem normalisierten Robinson-Foulds-Score gemessen, der zwischen 0 und 1 lag, wobei 0 perfekte Kongruenz darstellt. Zufällige Dendrogramme wurden als signifikant angesehen, wenn sie Robinson-Foulds-Werte erzielten, die gleich oder höher waren als diejenigen, die aus Vergleichen zwischen den Dendrogrammen der Säugetierphylogenie und dem mikrobiellen Gen (16S rRNA oder cpn60) erhalten wurden.

Um mikrobielle Gemeinschaften der Haut von Säugetieren mithilfe des cpn60-Gens zu untersuchen, wurden 95 repräsentative Hautabstrichproben, die bereits aus einem früheren Projekt [8] auf genomische DNA extrahiert und sequenziert wurden, für die zusätzliche Amplifikation und Sequenzierung des cpn60-Gens ausgewählt. Dieser cpn60-Gen-Amplikon-Datensatz enthielt Proben von 19 einzigartigen Säugetieren mit unterschiedlicher Darstellung hinsichtlich der Anzahl der Proben und Leseanteilen (Tabelle S1). Von den 95 zur Sequenzierung eingereichten Proben enthielten 88 eindeutige Proben mindestens einen Lesevorgang, wobei die meisten Proben mit weniger als 500 Gesamtlesevorgängen verbunden waren. Die Pferde- und Przewalski-Pferdproben machten 36,6 % bzw. 25,4 % aller sequenzierten cpn60-Genablesungen aus, gefolgt vom Olivenpavian (15,8 %) und der Kap-Elenantilope (10,0 %). Alle anderen Säugetier-Wirtsgruppen enthielten Reads, die weniger als 5 % der gesamten cpn60-Gen-Reads ausmachten. Um nachgelagerte Analyseprobleme im Zusammenhang mit geringen Probentiefen zu vermeiden, wurden alle Proben mit weniger als 1000 Messwerten entfernt, was zu einem endgültigen Datensatz von 37 Proben führte (Abb. 1). Diese Untergruppe trug 97,6 % (118.645) aller cpn60-Gen-Reads (121.622) bei. Obwohl der Leseverlust insgesamt minimal war, wurde die Repräsentation der Säugetierwirte von 19 auf 9 reduziert: Kap-Elenantilope, Esel, Ziege, Pferd, Olivenpavian, Przewalski-Pferd, Schaf, Topfhyäne und Sumatra-Orang-Utan (Abb. 1).

Die durchschnittliche Anzahl der Amplikons pro Säugetierwirt ist mit einem Kästchen angegeben.

Der Verlust der Repräsentation des Säugetierwirts aufgrund der geringen Sequenzierungstiefe war unerwartet und könnte methodische Ursachen haben. Die mikrobielle Biomasse auf der Haut von Säugetieren ist variabel und kann vergleichsweise gering sein, wobei Trockentupferproben der Haut im Vergleich zu anderen Methoden die geringste Menge an Biomasse produzieren [42]. Die in dieser aktuellen Studie verwendeten Proben wurden mit der Trockenabstrichmethode [8] gesammelt und weisen daher wahrscheinlich eine relativ geringe Biomasse und damit verbundene DNA-Ausbeuten auf. Darüber hinaus waren die Proben mehrere Jahre alt (d. h. vier Jahre zum Zeitpunkt der Sequenzierung) und wurden bei –20 °C statt der empfohlenen –80 °C für Hautabstrichproben gelagert [42]. Zusammengenommen könnten diese Faktoren die Integrität der genomischen DNA und der zugehörigen cpn60-Templates sowie die anschließende Sequenzierungstiefe beeinflusst haben. Das cpn60-Gen selbst hat eine durchschnittliche Kopienzahl von einer pro Genom [16] und daher könnten Proben anfälliger für DNA-Abbau sein, der sich auf die Zielamplifikation auswirkt. Zukünftige Untersuchungen spezifischer Gemeinschaften des Hautmikrobioms von Säugetieren unter Verwendung des cpn60-Gens würden von der Verwendung genomischer DNA profitieren, die kürzlich aus Hautproben von Säugetieren extrahiert wurde, idealerweise unter Verwendung von Nasstupfern oder Klebebandabziehen, um die Biomassesammlung zu erhöhen (42).

Trotz einer Verringerung der Wirtsrepräsentation lieferte die cpn60-basierte Sequenzierung wertvolle Einblicke in das Hautmikrobiom von Säugetieren. Die Olivenpavianproben enthielten unterschiedliche und vergleichsweise einheitliche mikrobielle Profile (Abb. 2). Diese Profile wurden durch Prevotella, Prophyromonas und Butyricoccus repräsentiert, die in den Olivenpavianproben am häufigsten vorkamen. Die Proben von Kap-Elenantilopen, Pferden und Przewalski-Pferden wiesen unter den Proben weniger einheitliche mikrobielle Profile auf. Die Cape-Eland-Proben enthielten mit Jeotgalicoccus assoziierte Sequenzen, die auch in den Ziegen-, Pferde- und Schafproben vorhanden waren. Bei den Pferdeproben waren die mikrobiellen Profile von Probe zu Probe unterschiedlich und enthielten einzigartige, mit Pferden assoziierte Sequenzen, die mit Moraxella assoziiert sind. Die mikrobiellen Profile der Przewalski-Pferdeproben waren einheitlicher und enthielten Sequenzen, die mit Planomicrobium und Macrococcus assoziiert waren; Diese Taxa waren in anderen Mikrobenprofilen von Säugetierwirten nahezu nicht vorhanden. Von Säugetierwirten mit Einzelprobendarstellung umfassten die mikrobiellen Profile der Sumatra-Orang-Utans mehr einzigartige Gattungen (neun) als Esel (vier), Ziege (zwei), Schafe (null) und Tüpfelhyäne (eine). In allen Proben dominierten Corynebacterium-assoziierte Sequenzen und waren in mäßiger relativer Häufigkeit (>5 %) bei Ziege, Pferd, Olivenpavian, Przewalski-Pferd und Schaf vertreten, obwohl sie in einigen Fällen bis zu 75 % der Gesamtgemeinschaft ausmachten. Mit Acidobacteria assoziierte Sequenzen waren auch bei Eseln, Pferden, Olivenpavianen und Przewalski-Pferden in relativer Häufigkeit zwischen 4 und 38 % vorhanden. Die am häufigsten beobachteten Sequenzen gehörten nicht klassifizierten Bakterien (Bacteria_394), die in 35 der 37 Proben in hoher Häufigkeit vorkamen, sowie einem unaufgelösten Proteobakterium (Proteobacteria_383) in 30 der 37 Proben.

Die generierten ASVs wurden auf die Gattungsebene reduziert und bei einer relativen Häufigkeit von > 3 % gefiltert. Die Blasengrößen stellen die relative Häufigkeit der Taxa in jeder Probe dar. Taxa, die auf einer Gattungsebene nicht aufgelöst waren, wurden entsprechend ihrer nächsten aufgelösten taxonomischen Ebene gekennzeichnet.

Vergleiche mit dem zuvor klassifizierten 16S-rRNA-Gendatensatz zeigten Inkonsistenzen zwischen den taxonomischen Profilen (Abb. 3, Tabelle S2). Obwohl unterschiedliche Genmarker verschiedenen Verzerrungen unterliegen, wie z. B. der Genkopienzahl [43, 44], dem Nukleotid-GC-Gehalt [45, 46], der Zielregion und den für die Amplifikation verwendeten Primern [47, 48] sowie bestimmten Bakterienanteilen [49] Die Hauptursache für die Unähnlichkeit taxonomischer Profile ist die separate Referenzdatenbank, die für jeden Datensatz verwendet wird. Die Verfügbarkeit kuratierter cpn60-Genreferenzdatenbanken ist begrenzt. Die einzige derzeit gepflegte cpn60-Datenbank ist cpnDB [22], deren nicht redundante Datenbank zum Zeitpunkt dieser Studie etwa 7000 Sequenzen enthielt. Obwohl diese durch Kombination mit Nukleotid-BLAST-Ergebnissen auf 17.713 Sequenzen erhöht wurde, wird die cpnDB von der SILVA 138.1 16S rRNA-Gendatenbank, die über 510.000 nicht-redundante Referenzsequenzen enthält, bei weitem übertroffen [50]. Ein großer Teil der cpn60-Genablesungen waren nicht klassifizierte Bakterien oder blieben im Vergleich zu den 16S-rRNA-Gendaten auf Gattungsebene ungelöst (Tabelle S2). Eine Erhöhung der Abdeckung der cpn60-Gendatenbank würde die Klassifizierung verbessern und direkte Vergleiche der Taxonomie zwischen mikrobiellen Profilen erleichtern, die aus separaten phylogenetischen Markern erstellt wurden.

Die ASVs wurden auf die Gattungsebene reduziert und bei einer relativen Häufigkeit von >5 % gefiltert. Die Blasengrößen stellen die relative Häufigkeit der Taxa in jeder Probe dar. Taxa, die auf einer Gattungsebene nicht aufgelöst waren, wurden entsprechend ihrer nächsten aufgelösten taxonomischen Ebene gekennzeichnet.

Zusätzlich zur begrenzten Datenbankabdeckung erfordern direkte Vergleiche taxonomischer Profile zwischen zwei phylogenetischen Markern, dass ASVs in taxonomische Ebenen (z. B. Gattung oder Art) zusammengefasst werden, was von der taxonomischen Strukturierung der Datenbank selbst abhängt. Ähnlich wie ASVs mit einem einzigen Nukleotidunterschied als einzigartiges ASV interpretiert werden können, werden taxonomische Abstammungslinien, die sich nur um ein Zeichen unterscheiden, innerhalb von QIIME2 als separate Taxa klassifiziert. In dieser Studie wurde dem 16S-rRNA-Gendatensatz mithilfe der SILVA-Datenbank (50, 51) eine Taxonomie zugewiesen, die ihre taxonomischen Informationen aus einer Kombination von Quellen, einschließlich NCBI und GTDB (52), bezieht und einer weiteren manuellen Annotation unterzogen wird. Im Gegensatz dazu unterhält die cpnDB derzeit keine Taxonomie-Referenzdatenbank. Stattdessen wurde dem cpn60-Gendatensatz eine Taxonomie basierend auf einer vom NCBI abgeleiteten Taxonomiedatenbank zugewiesen, die für diese Studie als Voraussetzung für die Implementierung in QIIME2 erstellt wurde. Daher könnten Unterschiede zwischen den cpn60- und 16S-rRNA-Genprofilen durch inkonsistente Taxonomien zwischen Datenbanken beeinflusst worden sein und die tatsächlichen Unterschiede möglicherweise nicht genau widerspiegeln. Beispielsweise waren in den Daten zwei Corynebacterium-Klassifizierungen (dh Corynebacterium_93 und Corynebacterium1_94) vorhanden (Abb. 3). Ein erfolgreicher Zusammenbruch auf die Gattungsebene hätte die assoziierten ASVs in eine einzige gemeinsame Corynebacterium-Gattung einordnen müssen. In diesem Fall besteht der Unterschied darin, dass am Ende der Corynebacterium-Linie in der 16S-rRNA-Gentaxonomiedatei eine „1“ eingefügt wird. Ebenso wird Massilia in Massilia_1203 und Massilia_1347 unterteilt (Daten nicht angezeigt). Hier sind die Unterschiede auf eine höhere taxonomische Klassifizierung zurückzuführen: Massilia wurde innerhalb der 16S-rRNA-Taxonomie basierend auf der GTDB in die Klasse Gammaproteobacteria umklassifiziert (52), während die NCBI-Taxonomie und die SILVA-Datenbank derzeit die ursprüngliche Abstammungslinie der Klasse Betaproteobacteria beibehalten. Daher werden ASVs, die derselben Gattung zugeordnet sind, als zwei separate Taxa statt als eines aufgeführt, und der Unterschied ist auf Gattungsebene „unsichtbar“. Sollte das cpn60-Gen weiterhin als alternativer phylogenetischer Marker zum 16S-rRNA-Gen verwendet und in der QIIME2-Umgebung implementiert werden, ist es wichtig, dass eine Referenztaxonomiedatenbank mit kompatiblen taxonomischen Abstammungslinien mit der SILVA-Datenbank (oder einer anderen routinemäßig abgerufenen Referenz) vorhanden ist Datenbanken) werden neben der cpnDB gepflegt, sodass direkte Vergleiche möglich sind. Alternativ wurde zuvor eine Kombination aus BLAST- und Smith-Waterman-Alignments (watered-BLAST) verwendet, um cpn60-Gendatensätzen eine Taxonomie zuzuweisen [25], obwohl diese Methode auch die NCBI-Taxonomiedatenbank verwendet und denselben taxonomischen Inkompatibilitätsproblemen unterliegen würde .

Mikrobiomdaten, die aus zwei separaten universellen prokaryotischen phylogenetischen Markern generiert wurden, sollten im Idealfall trotz etwaiger Unterschiede in der taxonomischen Klassifizierung ähnliche Zusammensetzungsprofile ergeben. PCoA- und Procrustes-Analysen wurden verwendet, um die Unähnlichkeit der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft zwischen cpn60- und 16S-rRNA-Gendatensätzen zu vergleichen, unabhängig von taxonomischen Klassifizierungen und Verzerrungen durch ausgewählte Referenzdatenbanken. Die aus beiden Datensätzen erstellten Ordinationen zeigten signifikante Korrelationen (p < 0,05) mit Korrelationskoeffizienten von 0,91, 0,69 und 0,66 für Bray-Curtis, gewichtetes UniFrac bzw. ungewichtetes UniFrac (Abb. 4). Die Zusammensetzung der Olivenpavianproben war unterschiedlich, wobei die Proben für jede getestete Metrik getrennt von denen anderer Säugetierwirte gruppiert wurden. Die Proben des Przewalski-Pferdes und des Kap-Elenantilopen wurden ebenfalls mit ihren jeweiligen Wirten gruppiert, und alle anderen Proben wurden für jede getestete Diversitätsmetrik homogen unter Säugetierwirten gruppiert.

Dreiecke (Pfeilspitzen) und Verbindungslinien zeigen die Änderung des Ordinationsraums von Stichproben zwischen Datensätzen an. Die Analysen wurden mit 100.000 Permutationen abgeschlossen, um die Signifikanz zu berechnen.

Da Bray-Curtis nur Präsenz- und Häufigkeitsdaten berücksichtigt, weist eine hohe Korrelation der Bray-Curtis-Metrik darauf hin, dass sowohl die cpn60- als auch die 16S-rRNA-Gendatensätze einen ähnlichen Anteil und eine ähnliche Verteilung von Taxa in ihren jeweiligen Proben enthalten. Die Einbeziehung phylogenetischer Daten (z. B. UniFrac) kann potenzielle Unterschiede in Bezug auf die ASV-Verwandtschaft aufdecken und Aufschluss darüber geben, ob die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft zwischen den cpn60- und 16S-rRNA-Gendatensätzen vergleichbar ist. Tatsächlich könnten schwächere Korrelationen, die mit den UniFrac-Metriken beobachtet wurden, darauf hinweisen, dass das cpn60-Gen-Amplikon zusätzliche phylogenetische Informationen liefert, die die V3-V4-Region des 16S-rRNA-Gens nicht liefern kann. Da es dem V3-V4-Fragment des 16S-rRNA-Gens häufig an ausreichender Nukleotiddiversität mangelt, um sicher Arten aufzulösen [15], sind Diversitätsmetriken, die von der phylogenetischen Auflösung abhängen, ähnlich begrenzt. Im Gegensatz dazu enthalten die cpn60-Gen-Amplikons genügend phylogenetische Informationen, um Arten aufzulösen und zugrunde liegende phylogenetische Bäume auszustrahlen [18, 53, 54, 55, 56]. Zusätzliche Validierungen unter Verwendung einer Teilmenge dieses aktuellen Datensatzes belegen, dass cpn60-Gen-Amplikons Taxa auf Artenebene klarer auflösen als die 16S-rRNA-Gen-Amplikons (Abb. S1). Die Unterschiede in der Auflösung wirken sich auf Unähnlichkeitsmessungen aus, was zu Änderungen in der beobachteten Probenähnlichkeit und letztendlich zu Unterschieden in der Procrustes-Korrelation zwischen Datensätzen führt. Speziell für die ungewichtete UniFrac-Metrik hätte die durch das cpn60-Gen bereitgestellte phylogenetische Auflösung erhebliche Auswirkungen, da die Auflösung von Taxa mit flachen Zweigen fast 90 % der Probenentfernung ausmacht [53], was zu geringeren Korrelationen führt. Für das gewichtete UniFrac sind tief verzweigte Taxa weitgehend für die Probenabstände verantwortlich [53] und sollten daher weniger von einer Erhöhung der phylogenetischen Auflösung beeinflusst werden, es sei denn, dies führt zu Änderungen der Tiefverzweigungstopologie (d. h. Änderungen auf Stamm- oder Klassenebene). . Dennoch deuten alle Procrustes-Tests (Abb. 4) darauf hin, dass die aus cpn60- und 16S-rRNA-Gendatensätzen generierten Zusammensetzungen der Mikrobengemeinschaft einander signifikant ähneln und verwendet werden können, um ähnliche Schlussfolgerungen hinsichtlich des mit dem Wirt des Säugetiers assoziierten Mikrobioms und der Phylosymbiose zu ziehen.

Die durch das cpn60-Markergen bereitgestellte phylogenetische Auflösung sollte zusätzliche Beobachtungen von Wirt-Mikroben-Assoziationen ermöglichen, insbesondere wenn diese Assoziationen auf feineren taxonomischen Ebenen vorliegen. Muster der Phylosymbiose innerhalb der mikrobiellen Profile des cpn60- und 16 S-rRNA-Gen-Amplikons wurden durch den Vergleich von Dendrogrammen der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft mit einem COXI-Säugetier-Dendrogramm bewertet, das die phylogenetische Geschichte von Säugetieren darstellt. Signifikante (p = 6,73 × 10−3) Muster der Phylosymbiose wurden im mikrobiellen Dendrogramm des 16S-rRNA-Gens Bray-Curtis für Gruppen beobachtet, die Kap-Elenantilopen, Ziegen und Schafe (Artiodactyla) sowie Esel, Przewalski-Pferde und Pferde (Perissodactyla) enthielten ), obwohl diese Beobachtungen für das cpn60-basierte mikrobielle Dendrogramm nicht signifikant waren (Abb. 5). Im Gegensatz dazu wurden für das cpn60-Gen-Amplikon ungewichtete (p = 4,36 × 10–2) und gewichtete (p = 4,43 × 10–2) mikrobielle UniFrac-Dendrogramme für Artiodactyla (Cape Eland ausgeschlossen) und Perissodactyla beobachtet, jedoch nicht innerhalb der 16S-rRNA-Gen-basierte Dendrogramme. Für Primaten (Olivenpavian und Sumatra-Orang-Utan) und Fleischfresser (Tüpfelhyäne) gab es keine Hinweise auf eine Phylosymbiose. Diese Beobachtungen bestätigen weiterhin, dass die mikrobiellen Gemeinschaften von Perissodactyla und Artiodactyla von der Evolutionsgeschichte des Wirts beeinflusst werden, wie zuvor unter Verwendung des 16S-rRNA-Gens beobachtet wurde [8]. Da die in die Studie einbezogenen Säugetierwirte sich in Standort und Alter unterschieden und möglicherweise stärker von „Umwelt“-Mikroorganismen beeinflusst werden, könnten Phylosymbiosemuster maskiert werden, wenn Säugetiere aus mehreren Säugetierordnungen gemeinsam in die Analyse einbezogen werden [8]. Diese aktuelle Studie stützt sich auf Proben, die ursprünglich aus derselben Veröffentlichung stammen. Daher können ähnliche Störfaktoren auch die aktuellen Beobachtungen beeinflussen und wurden bereits zuvor angesprochen [8]. Nichtsdestotrotz lieferten cpn60-basierte mikrobielle Dendrogramme mithilfe von UniFrac-Messungen signifikante und kongruente Phylosymbiose-Ergebnisse für Artiodactyla und Perissodactyla, ohne dass sie wie zuvor durchgeführt von anderen Säugetierordnungen isoliert werden mussten [8]. Dass phylogenetisch basierte UniFrac-Metriken nur mit den cpn60-basierten mikrobiellen Profilen zu signifikanten Phylosymbiose-Ergebnissen führten, lässt darauf schließen, dass die phylogenetische Auflösung des cpn60-Gens subtile Unterschiede in der Zusammensetzung aufdeckt und Phylosymbiosemuster aufdeckt, die im 16S-rRNA-Gendatensatz nicht beobachtet wurden. Allerdings ist die Repräsentation von Säugetierwirten in dieser aktuellen Studie begrenzt, und die Einbeziehung zusätzlicher Proben könnte zu einer erneuten Maskierung der Phylosymbiosemuster führen.

Blaue Quadrate zeigen identische Kladen zwischen der Säugetierphylogenie und dem mikrobiellen Dendrogramm an. Die Kongruenz wurde mit einem normalisierten Robinson-Foulds-Maß (nRF) auf Signifikanz getestet, das zwischen 0 und 1 liegt, wobei 0 perfekte Kongruenz darstellt. Signifikante Beobachtungen der Baumkongruenz werden mit einem „*“ gekennzeichnet.

Ein vorgeschlagener Vorteil der Verwendung des cpn60-Gens für die Mikrobiom-Profilierung ist die Fähigkeit, spezifische mikrobielle Populationen und ihre Assoziationen mit einer Umgebung oder einem Wirt universell zu erkennen und aufzulösen. Um diesen Vorteil zu testen, wurde die Familie Staphylococcaceae für eine zusätzliche Analyse ausgewählt, da verwandte Taxa unter Säugetierwirten allgegenwärtig sind [8] und bestimmte Mitglieder für die Gesundheit und Krankheit der Haut relevant sind. Von den 37 Proben enthielten 33 (89 %) Staphylococcaceae-assoziierte Messwerte. Der Anteil der mit Staphylococcaceae assoziierten Messwerte variierte zwischen den Säugetierwirten und reichte von 0,08 % (2/2307 Messwerte) bis 26,0 % (1339/5.142 Messwerte), wobei die relative Häufigkeit der meisten Proben (23/33, 69,9 %) unter 10 % lag (Abb . 6). Die Tüpfelhyänenprobe enthielt keine Staphylococcaceae-assoziierten Messwerte und wurde daher aus der weiteren Analyse entfernt. Die Olivenpavian- und Sumatra-Orang-Utan-Proben enthielten die geringste Anzahl an mit Staphylococcaceae assoziierten Messwerten, wobei keine Probe eine relative Häufigkeit von mehr als 1 % aufwies. Die Verteilung spezifischer Staphylococcaceae-Arten variierte zwischen den Säugetierwirten. Mit Jeotgalicoccus halophilus assoziierte Reads waren bei allen Säugetierwirten mit Ausnahme des Esels und des Przewalski-Pferdes vorhanden, und ungelöste Staphylococcaceae-Arten waren ebenfalls vorhanden, fehlten jedoch beim Przewalski-Pferd und dem Sumatra-Orang-Utan. Bei den Przewalski-Pferdeproben war Macrococcus carouselicus in den meisten Proben die vorherrschende Staphylococcaceae-Art, gefolgt von Macrococcus equipercicus, das in den Pferdeproben nicht vorkam. Die Pferde- und Przewalski-Pferdproben enthielten beide Salinicoccus-Arten, ansonsten gab es jedoch nur minimale Überschneidungen zwischen den Wirten. Die Pferdeproben waren am variabelsten und überlappten sich mit vielen anderen Säugetierwirten, enthielten jedoch Sequenzen, die eindeutig mit Staphylococcus fleurettii, Salinicoccus halodurans und Macrococcus brunensis assoziiert waren. Die Kap-Eland-Proben enthielten Staphylococcaceae-Populationen, die sich gleichmäßig in unaufgelöste Staphylococcaceae und Jeotgalicoccus halophilus aufteilten.

Auf Artenebene aufgelöste Taxa werden blau angezeigt. Die Blasengrößen stellen die relative Häufigkeit spezifischer Taxa in jeder Probe dar, berechnet aus der Gesamtzahl der Staphylococcaceae-Messwerte. Der Anteil der Staphylococcaceae-Reads im cpn60-Gen-Amplikon-Datensatz ist für jede Probe im unteren Balkendiagramm angegeben.

Vergleiche zwischen den cpn60- und 16S-rRNA-Gen-Amplikon-Staphylococcaceae-Profilen zeigen eine verbesserte Artenklassifizierung von Staphylococcaceae-Populationen bei Verwendung des cpn60-Gens (Abb. 6, Abb. S1). Die meisten der mit dem 16S-rRNA-Gen erstellten Profile enthielten große relative Häufigkeiten unaufgelöster Staphylococcaceae-Sequenzen, wobei nur zwei aufgelöste Arten im Datensatz vorhanden waren (d. h. Macrococcus brunensis und Salinicoccus roseus). Im Vergleich dazu enthielten die cpn60-Genprofile mit wenigen Ausnahmen hauptsächlich artspezifische Populationen. Der Vorteil einer verbesserten phylogenetischen Auflösung zeigt sich am deutlichsten bei Prezwalski-Pferdeproben, bei denen die meisten Staphylococcaceae-assoziierten Sequenzen zwischen dem 16S-rRNA-Gen und dem cpn60-Gen-Datensatz in Macrococcus carouselicus oder Macrococcus equipercicus aufgelöst wurden. Die Verteilung und relative Häufigkeit dieser Taxa lässt in Kombination mit früheren Beobachtungen der Phylosymbiose bei Perissodactyla auf eine Wirtsspezifität für Przewalski-Pferde und einen möglichen koevolutionären Einfluss schließen. Das Przewalski-Pferd gilt als echtes „Wildpferd“, da es in den asiatischen Steppen nicht domestiziert und relativ isoliert blieb [57], obwohl diese aktuellen Proben aus dem Zoo von Toronto (Ontario, Kanada) stammen. Die Hautumgebung von Przewalski-Pferden könnte sich von der der in dieser Studie verwendeten gewöhnlichen domestizierten Pferde unterscheiden und somit die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft beeinflussen. Wichtig ist, dass die in diese Analyse einbezogenen Pferde zwar regelmäßig gebürstet wurden (d. h. täglich bis wöchentlich), die Przewalski-Pferde jedoch ungepflegt blieben. Daher könnte die auf Przewalski-Pferden beobachtete Staphylococcaceae-Population eine „natürlichere“ Population darstellen, im Gegensatz zu domestizierten Pferden, deren Mikrobiota ständig durch menschliche Interaktion gestört wird. Unterschiede oder Störungen in den Staphylococcaceae-Populationen beim Prezewalski-Pferd und beim domestizierten Pferd könnten sich auf die Krankheitsanfälligkeit des Wirts auswirken, da Staphylococcaceae einen starken Zusammenhang mit der Entwicklung von Fesseldermatitis bei Pferden haben [58].

Der prominenteste Vertreter der Staphylococcaceae im Zusammenhang mit dem cpn60-Datensatz war Jeotgalicoccus halophilus. Der vergleichbare 16S-rRNA-Gendatensatz [8] enthält auch die Gattung Jeotgalicoccus mit ähnlichen Anteilen für die Kap-Elenantilope und mehrere Pferdeproben, obwohl die meisten mit Staphylococcaceae verbundenen Sequenzen zur Gattung Macrococcus gehören (83,7 %). Keines der Jeotgalicoccus-assoziierten ASVs im 16S-rRNA-Gendatensatz wurde in J. halophilus aufgelöst. Die Gattung Jeotgalicoccus wurde ursprünglich aus traditionellen koreanischen fermentierten Meeresfrüchten isoliert [59], während andere Vertreter als Aerosole aus Schweine- [60] und Truthahnfarmen [61] gefangen wurden. Insbesondere wurde J. halophilus erstmals aus einem Salzsee isoliert [62] und seitdem als luftgetragenes Bakterium in Brutstätten [63] und in Verbindung mit Meereskorallen nachgewiesen [64]. Zum jetzigen Zeitpunkt gibt es keine weitere Literatur, die J. halophilus im Zusammenhang mit der Haut von Säugetieren erwähnt, obwohl dies ihre frühere Entdeckung nicht ausschließt. Die Abfrage der NCBI-Datenbank lieferte Sequenzen aus zuvor erwähnten Umweltstudien, umfasste aber auch eine Rindermastitisstudie, in der J. halophilus nachgewiesen wurde [65].

Obwohl Jeotgalicoccus zuvor mithilfe des 16S-rRNA-Gens auf der Haut von Säugetieren nachgewiesen wurde [8], ermöglichte das cpn60-Gen die Trennung von J. halophilus von anderen darin vorkommenden Arten. Innerhalb der Primaten stellt J. halophilus die Gesamtheit der mit Staphylococcaceae assoziierten Lesevorgänge dar (Abb. 6), obwohl dies auf die geringe Lesetiefe der Staphylococcaceae zurückzuführen ist. Die Cape-Eland-Proben weisen jedoch eine erheblich höhere Lesetiefe für Staphylococcaceae auf, wobei J. halophilus mindestens die Hälfte aller Lesevorgänge ausmacht und das vorherrschende nach Arten aufgelöste Taxon ist. In ähnlicher Weise wies die Schafprobe, die den höchsten Anteil an Staphylokokken-assoziierten Lesevorgängen enthielt, auch einen hohen Anteil an J. halophilus auf, was darauf hindeutet, dass die relative Häufigkeit und Prävalenz dieses Taxons kein Artefakt begrenzter Lesetiefe ist. Da es außerdem in mehreren Proben und zwei Säugetierwirten (Esel und Przewalski-Pferd) sowie in Kontrollen nicht vorkommt, ist es unwahrscheinlich, dass es sich um eine Kreuzkontamination handelt, die während der Probenentnahme und -verarbeitung aus dem Labor eingeschleppt wird.

Die Bedeutung oder Rolle von J. halophilus im Zusammenhang mit der Haut von Säugetieren ist unbekannt. Als fakultativer Anaerobier mit grundlegenden Stoffwechselanforderungen, einem Wachstumsbereich von 4–40 °C und einer Salzverträglichkeit von 0,1 bis 16 % w/v [62] ist er gut für das Überleben auf der Haut von Säugetieren geeignet. Darüber hinaus ist es Koagulase- und Oxidase-positiv und resistent gegen mehrere natürliche Antibiotika [62], was auf seine Fähigkeit hindeuten könnte, als opportunistischer Krankheitserreger zu wirken. Es ist schwierig, Schlussfolgerungen über den Einfluss der nachgewiesenen wirtsassoziierten Staphylococcaceae auf Hautfunktion, Gesundheit und Krankheit zu ziehen. Beispielsweise ist Staphylococcus fleuretti, der in einer einzigen Pferdeprobe gefunden wurde, ein Koagulase-negativer Organismus, der mit verschiedenen Tierkrankheiten in Verbindung gebracht wird, und es wurde angegeben, dass er zur Methicillinresistenz in der Umwelt beiträgt [66]. Allerdings hatte das Pferd, von dem im Rahmen dieser aktuellen Studie die Probe entnommen wurde, keine gemeldeten Hautgesundheitsprobleme, litt jedoch an einer leichten Atemwegsinfektion [8]. Sogar etablierte Krankheitserreger wie S. aureus oder S. epidermidis können im Hautmikrobiom in krankheitsfreien Zuständen vorkommen und nur dann eine Pathologie verursachen, wenn die Hautbarriere durchbrochen oder die Gemeinschaft gestört ist [67, 68]. Daher kann der Nachweis krankheitsassoziierter Gattungen oder Arten auf der Haut von Säugetieren nur begrenzte Erkenntnisse über die Wirts-Mikroben-Dynamik liefern. Letztendlich sind weitere Arbeiten erforderlich, um die Wechselwirkungen dieser Mikrobenarten mit ihren Säugetierwirten weiter zu charakterisieren. Unabhängig davon ist die Tatsache, dass diese spezifischen Staphylococcus spp. auf der Haut von Säugetieren nachgewiesen wurden, belegen das Potenzial von cpn60, Arten aus vagen Gattungsklassifizierungen aufzulösen und für die universelle hochauflösende Profilierung des Hautmikrobioms von Säugetieren eingesetzt zu werden.

Es wurde gezeigt, dass mikrobielle Hautprofile von Säugetieren, die mit dem cpn60-Markergen erstellt wurden, mit 16S-rRNA-Gendatensätzen vergleichbar sind und frühere, auf dem 16S-rRNA-Gen basierende Beobachtungen der Phylosymbiose stützen. Hinweise auf Phylosymbiose wurden in den Säugetierordnungen Perissodactyla und Artiodactyla unter Verwendung des cpn60-Gen-Amplikon-Datensatzes und der phylogeniebasierten UniFrac-Distanzmetrik beobachtet; Dieser Beweis fehlte im 16S-rRNA-Gen-Amplikon-Datensatz. Die Auflösung von Arten innerhalb vager Gattungsklassifikationen bietet Einblicke in die Verbreitung, das Vorhandensein und den potenziellen Einfluss spezifischer wirtsassoziierter Taxa und deren Einfluss auf die Gesundheit und Krankheit der Haut. Der cpn60-Gen-Amplikon-Datensatz enthüllte zuvor nicht beobachtete Assoziationen zwischen Säugetierwirten und bestimmten Taxa wie Jeotgalicoccus halophilus, die andernfalls unentdeckt geblieben wären. Die Amplifikation des cpn60-Gens schließt bestimmte Bakteriengemeinschaften nicht gegenüber anderen aus (z. B. archaeenspezifische oder artspezifische Primer) und kann daher sowohl für die gesamte mikrobielle Gemeinschaft als auch für die artspezifische Profilierung verwendet werden. Obwohl das 16S-rRNA-Gen wahrscheinlich der am häufigsten verwendete phylogenetische Marker für Amplikon-basierte Studien bleiben wird, ist das cpn60-Gen eine Ergänzung zu Mikrobiomstudien, bei denen eine universelle taxonomische Auflösung auf niedrigem Niveau gewünscht ist. Wenn jedoch cpn60-Amplikonstudien mit denen verglichen werden sollen, die unter Verwendung des 16S-rRNA-Gens erstellt wurden, ist es zwingend erforderlich, neben der cpnDB-Sequenzreferenzdatenbank eine standardisierte Taxonomiedatenbank zu pflegen. Diese Studie integrierte cpnDB mithilfe der NCBI-Taxonomiedatenbank in die QIIME2-Umgebung und ermöglichte so in Zukunft eine schnellere Analyse von cpn60-Gen-Amplikon-Datensätzen. Anstelle einer separaten Taxonomiedatenbank würden jedoch Fortschritte bei der Integration der cpnDB in bestehende Taxonomiedatenbanken wie SILVA (50, 51) oder das Ribosomal-Datenbankprojekt (69) zukünftige cpn60-basierte Forschung erleichtern und die taxonomische Zuordnung innerhalb dieser Datenbanken verbessern und außerhalb der QIIME2-Umgebung.

Alle im Rahmen dieser aktuellen Studie generierten Daten sind im Repository des European Nucleotide Archive (ENA) unter der Projektzugangsnummer PRJEB43503 verfügbar. Die vollständige cpn60-ASV-Tabelle, die für diese Studie verwendet wurde, ist unter https://figshare.com/articles/dataset/cpn60_ASV_table/14955753 verfügbar.

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Diese Forschung wurde durch einen Discovery Grant des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) unterstützt.

Abteilung für Biologie, University of Waterloo, Waterloo, Ontario, Kanada

Alexander K. Umbach & Josh D. Neufeld

Abteilung für Veterinärmikrobiologie, University of Saskatchewan, Saskatoon, Saskatchewan, Kanada

Frau Ferdinand und Janet E. Hill

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AKU: Konzeptualisierung, Untersuchung, Methodik, formale Analyse, Visualisierung, Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung. CF: Methodik, Validierung. JEH: Supervision, Konzeptualisierung, Methodik, Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten. JDN: Supervision, Konzeptualisierung, Methodik, Finanzierungseinwerbung, Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten.

Korrespondenz mit Josh D. Neufeld.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Umbach, AK, Fernando, C., Hill, JE et al. Evaluierung von cpn60 zur hochauflösenden Profilierung des Hautmikrobioms von Säugetieren und zur Erkennung von Phylosymbiose. ISME COMMUN. 3, 69 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00276-y

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Eingegangen: 20. März 2023

Überarbeitet: 19. Juni 2023

Angenommen: 21. Juni 2023

Veröffentlicht: 07. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00276-y

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