Ultra

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 13017 (2023) Diesen Artikel zitieren

152 Zugriffe

Details zu den Metriken

Die Identifizierung von Arten ist notwendig, um die Einschleppung exotischer Pflanzenschädlinge durch den globalen Handel zu verhindern. Viele dieser Schädlinge sind wenig erforscht und es fehlen öffentlich verfügbare DNA-Sequenzdaten, auf denen schnelle molekulare Identifizierungsmethoden basieren könnten. Eine dieser Abstammungslinien ist die Gattung Chrysodeixis, zu der drei Arten gehören, die für US-Handelsinitiativen möglicherweise Anlass zur Sorge geben: C. includens, C. chalcites und C. eriosoma. Hier beschreiben wir eine Methode zur Erstellung robuster 45S-rDNA-Profile mithilfe von Long-Read-Sequenzierung, um evolutionäre Beziehungen zu klären und eine Echtzeit-PCR-Identifizierungstechnik zu entwickeln. Ein solches Identifizierungstool wird bei der schnellen Unterscheidung zwischen unter Quarantäne gestellten Chrysodeixis-Arten nützlich sein, bei denen herkömmliche morphologische Identifizierungsmethoden unzureichend sind. Molekulare Methoden wie diese reduzieren den Zeitaufwand für die Identifizierung jeder einzelnen Probe erheblich, ermöglichen den Nachweis von eDNA, erhöhen den Durchsatz erheblich und erhöhen die Nachweiswahrscheinlichkeit. Die hier vorgestellten Methoden lassen sich im Allgemeinen an alle wenig erforschten Lepidopteren-Taxa anpassen, die einen molekulardiagnostischen Test erfordern, und könnten mit Anpassung oder Test der Primer auf jede Gruppe angewendet werden, für die sich die Entwicklung von rDNA-Profilen in einer Tischumgebung als nützlich erweisen würde.

In einer globalisierten Welt, in der die vom Menschen verursachte Umsiedlung von Arten (insbesondere Pflanzen und Insekten) schneller als je zuvor erfolgt, wird die Artendiagnostik immer wichtiger1,2. Angesichts der zunehmenden Bewegung von Menschen und des weltweiten Transports landwirtschaftlicher Güter, einschließlich Nahrungsmittelpflanzen, Schnittblumen und Holzverpackungsmaterial, ist die Fähigkeit, alle damit verbundenen Insekten schnell zu erkennen und zu identifizieren, von größter Bedeutung, um die Einführung und Etablierung invasiver Schädlingsarten zu begrenzen3,4. In den Vereinigten Staaten werden Fracht- und Warenkontrollen in Einreisehäfen sowie Inlandsuntersuchungen auf exotische Schädlinge durchgeführt, um das Vorhandensein von Insektenschädlingen festzustellen. Die Identifizierung dieser Proben kann schwierig sein und hängt oft von einer genauen Aufzeichnung des Wirts, auf dem der Organismus gefunden wurde, und der Herkunft der Sendung ab, die beide aufgrund des Umschlags über mehrere Standorte kompliziert sein können5. In vielen Fällen können gefangene Schädlinge nur der Familie, Unterfamilie oder Gattung zugeordnet werden. Dies gilt insbesondere für Schmetterlinge, die fast ausschließlich im Larvenstadium abgefangen werden.

Die Identifizierung von Insekten, die bei häuslichen Untersuchungen gefangen wurden, ist ebenfalls eine Herausforderung, da die gegenseitige Anziehung von Pheromonködern dazu führen kann, dass Dutzende oder Hunderte ähnlicher Nichtziele in einer einzigen Falle gefangen werden. Eine schnelle Identifizierung potenzieller Ziele ist wünschenswert, um invasive Arten vor der Etablierung (d. h. der Verzögerungsphase6) zu erkennen. Dies erfordert jedoch häufig die Sektion jeder einzelnen Probe oder einen molekularen Ansatz, wie z. B. Cytochrom-C-Oxidase-1 (CO1)-DNA-Barcoding7. Beide Ansätze sind zeitaufwändig und möglicherweise nicht zuverlässig für Arten, die bisher unbeschrieben oder schlecht charakterisiert sind oder für die es keine öffentlich verfügbaren Sequenzdaten gibt. Um die Chancen der Erkennung invasiver Arten zu verbessern, wurden für einige häufig abgefangene und potenziell invasive Insektenschädlingsarten Schnell- oder Hochdurchsatz-Molekulartests entwickelt (z. B. 8,9,10,11). Hochdurchsatzverfahren zur molekularen Identifizierung erhöhen nicht nur die Nachweiswahrscheinlichkeit, sondern reduzieren auch den Zeit- und Kostenaufwand für die vollständige Identifizierung erheblich, insbesondere im Fall von Multiplex-Assays12,13. Einige Arten, die ein hohes Invasionspotenzial darstellen, sind ebenfalls wenig erforscht und es mangelt ihnen an grundlegenden Informationen wie der phylogenetischen Platzierung und Beschreibung von Schwesterarten, der phylogeografischen Variation innerhalb der Art oder öffentlich verfügbaren Sequenzdaten7,14.

Während für viele Arten eine große Datenbank mit CO1-Sequenzen verfügbar ist (z. B. BOLD15, GenBank16), kann diese Region aufgrund des hohen AT-Gehalts, der geringen Variation zwischen den Arten usw. für die Entwicklung von auf DNA-Sequenzen basierenden Techniken wie Echtzeit-PCR schlecht geeignet sein /oder hohe Variationen innerhalb der Spezies aufgrund schneller Evolution und genetischer Drift17. In diesen Situationen kann die Artenidentifizierung oft zuverlässig mithilfe von Regionen der 45S-ribosomalen RNA (rRNA) durchgeführt werden. Unter den ersten Nukleinsäuren, die sequenziert wurden, ist die 45S-rRNA im Genom sehr häufig und von relativ kurzer Länge18. Die rRNA-Einheit besteht aus strukturell konservierten Tandemwiederholungen, die aus einem externen transkribierten Spacer (ETS), 18S-rRNA, internem transkribiertem Spacer (ITS) 1, 5,8S-rRNA, ITS2 und 28S-rRNA19 bestehen. Diese Eigenschaften der rRNA sowie die Sequenzkonservierung in den kodierenden Regionen und die hohen Evolutionsraten in den nichtkodierenden ITS-Regionen in der zugrunde liegenden ribosomalen DNA (rDNA) führten zur Verwendung dieses Locus für phylogenetische Studien im gesamten Stammbaum von Leben20,21. Aus diesen phylogenetischen Studien wurden große Mengen an rDNA-Sequenzdaten öffentlich zugänglich gemacht, aus denen Forscher Methoden zur schnellen Artenidentifizierung entwickelt haben. Diese Loci sind ideal für solche molekularen Tests, da die ITS-Regionen innerhalb der Arten relativ konserviert sind, zwischen den Arten sehr unterschiedlich sind (sowohl mit Punktmutationen als auch mit Indels) und in hohen Kopienzahlen im Genom vorhanden sind. Dies macht sie zu idealen Kandidaten für die Entwicklung sondenbasierter PCR-Assays8,22,23 und ermöglicht die Amplifikation dieser Sequenzen selbst aus degradierter DNA oder in hochkomplexen Umweltproben24,25. Da die 18S-, 28S- und 5,8S-rRNA-kodierenden Sequenzen hoch konserviert sind, ist die Entwicklung universeller Primer zur Amplifikation dieser gesamten Region möglich, selbst wenn für die betreffende Art keine rDNA-Sequenzdaten verfügbar sind. Aufgrund der hohen Anzahl an Kopien innerhalb eines einzelnen Genoms bestehen jedoch Nukleotidunterschiede zwischen den Kopien innerhalb eines Individuums. Diese intraindividuellen Variationen gelten als Ribotypen26,27, und solche ribotypischen Variationen sollten bei der Entwicklung einer zuverlässigen DNA-basierten Technik zur Artenidentifizierung vermieden werden, doch die Charakterisierung ribotypischer Variationen ist selten abgeschlossen. Die Verwendung einer Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethode ist daher nützlich für die Charakterisierung der ribotypischen Diversität und für die Unterscheidung zwischen festen und vorübergehenden Variationen, die zwischen Wiederholungen bestehen.

Um den Nutzen und die Machbarkeit der Erstellung eines rDNA-Profils zur Entwicklung molekularer Identifizierungstechniken zu untersuchen, haben wir eine wirtschaftlich wichtige Gruppe betrachtet, für die nur wenig molekulare Forschung verfügbar ist: Chrysodeixis (Hübner), eine Mottengattung in der Unterfamilie Plusiinae (Noctuidae). Innerhalb der Gattung sind drei Arten in den USA von wirtschaftlicher Bedeutung und würden von einer molekularen Identifizierung profitieren. Die erste ist Chrysodeixis includens (Walker), die in weiten Teilen Amerikas vorkommt und dort subtropisches gegenüber tropischem Klima bevorzugt. Obwohl die Art wahrscheinlich nur in den südlichen oder südöstlichen Teilen der USA überwintert und bis nach Nova Scotia wandert, ist sie die häufigste Plusiine in landwirtschaftlichen Gebieten im Osten der USA28. Larven sind polyphag und wurden bei 174 Pflanzenarten in 39 Familien nachgewiesen, und C. includens ist einer der wichtigsten Sojaschädlinge in seinem heimischen Verbreitungsgebiet (z. B. 29, 30, 31). Der zweite, C. eriosoma (Doubleday), kommt in tropischen Lebensräumen in Asien und Ozeanien vor, einschließlich Populationen auf den Hawaii-Inseln, Französisch-Polynesien32 und Neuseeland, wo er als einer der wichtigsten Schädlinge von Gartenbaukulturen gilt33. Larven sind polyphag und ernähren sich von einer Reihe von Arten aus Familien, darunter Asteraceae, Fabaceae und Solanaceae. Schließlich kommt C. chalcites (Esper) in subtropischen bis tropischen Lebensräumen im gesamten Mittelmeerraum, in Westasien und in weiten Teilen Afrikas vor34. Wie die beiden zuvor besprochenen Arten sind Larven stark polyphag und ernähren sich von Pflanzen der Gattung Asteraceae, Brassicaceae, Fabaceae, Poaceae, Solanaceae und vielen anderen35. Larven von C. chalcites gelten als Hauptschädlinge für Tomaten, Luzerne, Kartoffeln, Gurken, Paprika und andere wirtschaftlich wichtige Nutzpflanzen36. Während keine der drei Arten in gemäßigten Regionen überwintert, ist bekannt, dass C. chalcites das ganze Jahr über Populationen in Gewächshäusern in Europa und sogar im Norden bis nach Norwegen aufbaut34. Es wurde auch in Michigan, Ohio, British Columbia und Ontario entdeckt36,37,38. Exemplare von C. chalcites wurden zwischen 1984 und 2014 über 300 Mal an Bundeseinreisehäfen in den Vereinigten Staaten abgefangen34, davon allein 84 Mal in Kalifornien, und es wird vorhergesagt, dass sie schwerwiegende Auswirkungen haben werden, wenn sie dort entdeckt werden39.

Aufgrund ihrer morphologischen und biologischen Ähnlichkeit ist die Taxonomie und Identifizierung von C. chalcites und C. eriosoma kompliziert. Die Typusexemplare von C. chalcites und C. eriosoma wurden an geografisch unterschiedlichen Standorten gesammelt, wurden jedoch im Allgemeinen als Synonyme behandelt, bis Kostrowicki40 die beiden Arten aufgrund geringfügiger Unterschiede im Flügelmuster und den männlichen Genitalien trennte. Spätere Autoren (z. B.41) akzeptierten oder lehnten die Abgrenzung von Kostrowiki ab, stellten jedoch im Allgemeinen fest, dass mehr Arbeit erforderlich sei und dass, wenn es sich um zwei Arten handele, sie morphologisch nicht zuverlässig getrennt werden könnten36. Die Verbreitungsgebiete beider Arten überschneiden sich im Nahen Osten und in Westasien, und beide werden bei Untersuchungen zur Plusiinenvielfalt routinemäßig in Indien und Pakistan gefunden42,43. Proben werden regelmäßig falsch identifiziert und die aktuelle Methode zur Trennung basiert auf der CO1-Barcodierung und der Berücksichtigung der geografischen Herkunft44. Im Jahr 2005 aus British Columbia gemeldete Chrysodeixis-Exemplare wurden ursprünglich als C. eriosoma38 beschrieben, später jedoch von Lafontaine und Schmidt44 als C. chalcites identifiziert.

Aufgrund der hohen Anzahl von Funden von Plusiin-Larven auf importierten Waren und der jüngsten Entdeckungen invasiver Populationen von C. chalcites in Nordamerika ist eine molekulare Methode zur schnellen und zuverlässigen Diagnose von Individuen erforderlich. Hier stellen wir eine Echtzeit-PCR-Methode zur Identifizierung wirtschaftlich wichtiger Chrysodeixis vor, die routinemäßig bei inländischen Untersuchungen angetroffen oder an Einreisehäfen abgefangen werden, und zwar unter Verwendung einer Deep-Coverage-Long-Read-Sequenzierung. Teile der 45S-rDNA-Profile für jede Probe wurden zusammen mit CO1-Sequenzdaten verwendet, um die Beziehungen zwischen den drei Arten zu klären. Die hier beschriebene 45S-rDNA-Sequenzierungsmethode ist universell auf alle Schmetterlinge anwendbar und mit geeigneter Anpassung der Primer an nahezu jede Abstammungslinie anpassbar.

Long-Read-Sequenzierung (Oxford Nanopore Technologies) wurde verwendet, um ein 45S-rDNA-Profil von einem einzelnen Individuum für jede der drei Chrysodeixis-Arten zu entwickeln, wobei Amplifikate aus Langstrecken-PCRs verwendet wurden. Die zusammengesetzten Amplikons waren 6474 bp für C. includens, 6493 bp für C. eriosoma und 6494 bp für C. chalcites. Einzelne rDNA-Sequenzen waren in der gesamten Region unterschiedlich und zeigten sowohl Indel- als auch Punktmutationen. Die meisten Unklarheiten waren selten, möglicherweise aufgrund von PCR- oder Sequenzierungsfehlern, und hatten keinen Einfluss auf die endgültige Zusammenstellung. In den rDNA-Profilen für jede Artenprobe wurden mit LoFreq45 identifizierte feste Mehrdeutigkeiten als „Ribotypen“ betrachtet (Ergänzungstabelle 1). Sowohl für C. includens als auch für C. chalcites wurden vier Loci zur Untersuchung mittels Sanger-Sequenzierung ausgewählt. Von diesen wurde ein Ribotyp, der als festes W (A oder T) erscheint, in C. chalcites an Position 4775 mit LoFreq nachgewiesen und mit Sanger-Sequenzierung bestätigt (ergänzende Abbildung 1A), die restlichen drei waren nicht schlüssig oder konnten mit Sanger-Sequenzierung nicht nachgewiesen werden. Vier (bei 1916, 2426, 2535 und 4502) von sieben in C. includens unter Verwendung von LoFreq gefundenen Ribotypen wurden durch Sanger-Sequenzierung bestätigt (ergänzende Abbildung 1B – E). Die endgültige Zusammenstellung des C. eriosoma-rDNA-Segments ergab keine festen Variationen. Ein TCS-Netzwerk ribotypischer Diversität innerhalb und zwischen den drei sequenzierten Individuen ist in Abb. 1 dargestellt. Diese intragenomischen ribotypischen Varianten wurden während des Echtzeit-PCR-Primer- und Sondendesigns vermieden (Ergänzungsdatei 1).

Das TCS-Netzwerk nachweisbarer ribotypischer Diversität in C. eriosoma, C. chalcites und C. umfasst 45S-rDNA-Endassemblierungen. Punkte stellen Ribotypen innerhalb von Individuen dar: 1 Ribotyp innerhalb von C. eriosoma, zwei innerhalb von C. chalcites und 16 mögliche Kombinationen von vier ribotypischen Loci in C. includens. Schraffurmarkierungen zwischen Knoten stellen SNVs dar, die Arten und Ribotypen trennen.

Beim Alignment der rDNA-Sequenzen von C. chalcites und C. eriosoma wurden 13 variable Positionen zwischen den beiden gefunden, von denen 11 innerhalb der ITS-Regionen lagen, aber nicht von Sequenzen flankiert waren, die für das Primer- oder Sondendesign geeignet waren, und zwei in 28S (Ergänzungsdatei 1). Aufgrund der früheren Debatten über den Artenstatus von C. eriosoma und dieser Sequenzierungsergebnisse haben wir verfügbare, bevölkerungsweite CO1-Barcode-Daten für jede Art und unser eigenes Probenarchiv verwendet, um die Beziehung zu untersuchen. Unter Verwendung von CO1-Sequenzdaten von C. includens, C. chalcites und C. eriosoma lösten Neighbor-Joining (NJ)- und Bayesian Inference (BI)-Bäume jeweils drei gut unterstützte Kladen auf, die jeder der drei Arten entsprachen (Abb. 2A; Ergänzung). Abb. 2A). Das aus derselben Ausrichtung erstellte TCS-Netzwerk zeigt haplotypische Diversität innerhalb jeder Art (Abb. 2B). Wie im Bayes'schen CO1-Baum (ergänzende Abbildung 2A) und im TCS-Netzwerk (Abbildung 2B) gezeigt, wurden Exemplare von C. eriosoma in zwei Haplogruppen eingeteilt, die in etwa dem Sammelort mit Exemplaren aus dem Nahen Osten, Indien, Pakistan und Südostasien gruppieren sich und Exemplare aus Australien, Neuseeland und Französisch-Polynesien gruppieren sich (Abb. 2A; ergänzende Abb. 2A). Die hawaiianischen Exemplare wurden mit denen aus Indien verglichen und beide Haplogruppen wurden in Papua-Neuguinea gesammelt. Umgekehrt zeigten C. chalcites eine erhöhte Verzweigung innerhalb der Klade und längere Verzweigungslängen zwischen den Gruppen, alle mit hoher Verzweigungsunterstützung (Abb. 2A) und einer großen Haplogruppe mit einer kleineren Haplogruppe und zwei Singletons im TCS-Netzwerk (Abb. 2B). Schließlich zeigte C. includens keine ortsspezifische Struktur, da sich alle Exemplare trotz der geografisch verteilten Sammlungen (Abb. 2A) und einer großen Haplogruppe, die sich über den geografischen Bereich erstreckt (Abb. 2B), in einer einzigen Gruppe auflösen. Insgesamt 28 Single Nucleotide Variations (SNVs) trennen C. includens sowohl von C. chalcites als auch von C. eriosoma, während nur 4 SNVs die am engsten verwandten Haplotypen von C. chalcites und C. eriosoma trennen.

Die Analyse von Chrysodeixis-Arten auf Basis von CO1 klärt die evolutionären Beziehungen zwischen C. includens, C. chalcites und C. eriosoma auf. (A) Ein benachbarter Baum zeigt Variationen innerhalb und zwischen den Arten. Jede Probe ist mit einem aus drei Buchstaben bestehenden Ländercode gekennzeichnet, der den Sammelort angibt, und ist nach Kontinent/Region farblich gekennzeichnet. Zweigbeschriftungen stellen die Unterstützung von Klappmessern dar. Helicoverpa armigera wurde als Außengruppe festgelegt. Der Maßstabsbalken stellt die genetische Distanz dar. (B) Ein TCS-Netzwerk derselben Sequenzen zeigt die Anzahl der sparsamen informativen SNVs, die jede Gruppe trennen. Schraffurmarkierungen zwischen den Knoten geben die Anzahl der SNVs an und Haplotypen werden durch große Kreise dargestellt.

Eine Artenabgrenzungsanalyse wurde durchgeführt, um die Gültigkeit der C. chalcites/C. Eriosoma-Arten spalteten sich. Mithilfe der Artenabgrenzung46 wurden zwei Hypothesen an einem CO1-NJ-Baum getestet: C. chalcites und C. eriosoma als getrennte Arten (Abb. 3A) oder C. chalcites und C. eriosoma als einzelne Arten (Abb. 3B). In beiden Tests sind die Abstammungslinien durch Rosenbergs PAB47 reziprok monophyletisch, und unter der Hypothese einer einzelnen Art (Abb. 3B) wird das Verzweigungsmuster durch Rodrigos P48 als zufällig unterschiedlich angesehen. Gemäß der Zwei-Arten-Hypothese (Abb. 3A) weist jedoch jede Abstammungslinie ein statistisch signifikantes Rodrigo-P auf, was darauf hindeutet, dass in jedem Zweig ein Selektionstrieb vorhanden ist. Umgekehrt unterscheidet sich C. includens zufällig von Rodrigos P, ist aber reziprok monophyletisch mit C. acuta. Da es in der kleinen Stichprobe von C. acuta, die in diese Analyse einbezogen wurde, zwei gut unterstützte Kladen gibt, wurden diese Hypothesen auch für C. acuta als Vergleichssubstanz getestet (ergänzende Abbildung 3). In ähnlicher Weise zeigt Rodrigos P an, dass die Verzweigung innerhalb der Gruppe als Ganzes zufällig erfolgt, sie ist reziprok monophyletisch mit C. includens gemäß Rosenbergs P, aber die Gruppen werden als unterschiedlich bestätigt, wenn sie separat getestet werden (ergänzende Abbildung 3). Der Intra-Clade-Abstand für C. acuta ist größer als der Intra-Clade-Abstand für C. chalcites und C. eriosoma, wenn sie als einzelne Art betrachtet werden (Abb. 3B, ergänzende Abb. 3).

Die Artenabgrenzungsanalyse wurde anhand von CO1-Daten anhand zweier Hypothesen durchgeführt. (A) Es wird ein benachbarter Baum gezeigt, der C. chalcites, C. eriosoma, C. includens und C. acuta als 4 einzelne Arten vergleicht. Jede Gruppe, die eine Art darstellt, wurde reduziert und farblich gekennzeichnet. (B) Zeigt denselben Baum mit C. chalcites und C. eriosoma, die als eine einzige Art behandelt wurden und beim jüngsten gemeinsamen Vorfahren zusammengebrochen sind.

Unter Verwendung von ITS1 zeigten ein NJ-Baum (Abb. 4A) und eine Bayes'sche Analyse (ergänzende Abb. 2B) eine geringere Auflösung zwischen C. chalcites und C. eriosoma im Vergleich zu CO1 (Abb. 2A; ergänzende Abb. 2B). Darüber hinaus zeigte ITS1 von Individuen jeder Art eine geringere Differenzierung zwischen ihnen, als die rDNA-Profile enthalten (Ergänzungsdatei 1), was durch das TCS-Netzwerk unterstützt wird, das innerhalb der kleinen Stichprobe von C. includens eine größere Diversität aufweist als die beiden größeren Proben von C. eriosoma und C. chalcites voneinander (Abb. 4B). Die geringen Probengrößen und begrenzten Probensammelorte für die für diese Studie generierten ITS1-Sequenzdaten behindern ihre Anwendung als phylogeografischer Ort oder Ort zur Artenabgrenzung, sodass keine weiteren Analysen durchgeführt wurden.

Analyse von Chrysodeixis-Arten basierend auf ITS1-Sequenzierung. (A) Ein Nachbarbaum zeigt Variationen innerhalb und zwischen Kladen, die jede der analysierten Arten enthalten: C. includens, C. chalcites und C. eriosoma. Zweigetiketten weisen auf die Unterstützung von Klappmessern hin. Als Außengruppe wurde Helicoverpa zea festgelegt. Der Maßstabsbalken stellt die genetische Distanz dar. (B) Ein TCS-Netzwerk der ITS1-Sequenzen zeigt die sparsamen informativen SNVs (Schraffurmarkierungen), die jede Gruppe trennen.

Es wurde ein Echtzeit-PCR-Assay entwickelt, der als Triplex-Sonden-basierter Assay mit einem Oligo-Set zur Identifizierung von C. includens (FAM in ITS2) und einem Oligo-Set zur Identifizierung von C. chalcites und C. eriosoma (HEX in ITS1) und ein Oligo-Set als Kontrolle (Quasar 670 in 18S23). Alle getesteten Chrysodeixis-Proben lieferten positive Ergebnisse für die erwartete Sonde sowie für die 18S-Kontrollsonde. Es gab keine Kreuzreaktivität zwischen den FAM- und HEX-Sonden. Die FAM-Sonde hatte einen Cq-Bereich von 11,57 bis 25,44 (Mittelwert 15,77 ± SD 2,59) und die HEX-Sonde hatte einen Cq-Bereich von 15,19 bis 23,98 (Mittelwert 18,77 ± 1,75 SD). Die 18S-Kontrollsonde lieferte für alle drei Arten durchweg einen höheren Cq-Wert als die beiden Diagnosesonden und unterschied sich in der Effizienz zwischen den Arten nicht wesentlich. Der ΔCq zwischen den FAM- und Quasar 670-Sonden lag im Bereich von –2,22 bis 2,86 (Mittelwert 2,08 ± SD 0,70) und der ΔCq zwischen den HEX- und Quasar 670-Sonden lag im Bereich von 0,66 bis 1,39 (Mittelwert 1,04 ± SD 0,19), was darauf hinweist, dass die Empfindlichkeit für beide gilt Diagnosesonden ist höher als die der Kontrollsonde.

Standardkurven wurden sowohl für die FAM- (Abb. 5A) als auch für die HEX-Sonde (Abb. 5B) in Verbindung mit der Quasar 670-Kontrollsonde erstellt. Im Allgemeinen führte eine abnehmende DNA-Konzentration zu einem Anstieg des Cq für alle getesteten Konzentrationen aller drei Arten. Alle Wiederholungen des Sensitivitätstests wurden mit allen drei vorhandenen Oligo-Sets durchgeführt, was darauf hindeutet, dass Multiplexing nur geringe Auswirkungen auf die Testempfindlichkeit hatte. Basierend auf der Standardkurve kann die FAM-Sonde C. includens-DNA bei ≥ 0,001 ng/µL nachweisen (Abb. 5A), während die HEX-Sonde C. chalcites- oder C. eriosoma-DNA bei ≥ 0,0001 ng/µL nachweisen kann (Abb. 5B). ).

Die Standardkurve der Cq-Werte für (A) C. umfasst (ITS2) und (B) C. Chalcite/C. Eriosoma (ITS1)-Primer- und Sondensätze werden für Reihenverdünnungen gereinigter DNA jeder Spezies gezeigt, die im Triplex-Echtzeit-PCR-Assay durchgeführt wurden. In jedem Diagramm stellen die Dreiecke und die durchgezogene Linie die Diagnosesonde und die Quadrate und die gestrichelte Linie die 18S-Kontrollsonde dar.

Falsch positive Tests wurden mit 17 Arten (n = 67) von Nichtzielarten durchgeführt, die häufig in Chrysodeixis-Erhebungen gesammelt oder bei Abhörvorgängen in US-Häfen falsch identifiziert wurden (Ergänzungstabelle 2). Diese Daten wurden verwendet, um den RFU-Schwellenwert für jede Sonde empirisch zu bestimmen. Davon gab es drei falsch positive Ergebnisse für die HEX-Sonde und ein falsch positives Ergebnis für die FAM-Sonde. Basierend auf der End-RFU der Nichtziele wurde der Basisschwellenwert für alle drei Sonden auf 1000 RFU festgelegt. Dieser Schwellenwert wurde für alle gemeldeten Daten verwendet. Für die beobachteten falsch-positiven Ergebnisse betrug der ΔCq > 8 Zyklen, weshalb sie nicht als Ziele in Betracht gezogen wurden.

Basierend auf dem ΔCq für alle drei Sonden, falsch-positiven Tests und Empfindlichkeitstests wurde ein Regelsatz entwickelt, um die Identität von Proben mithilfe des Multiplex-Assays zu bestimmen (Abb. 6). Um C. chalcites und C. eriosoma aus diesen Ergebnissen zu trennen, könnte die Herkunft der Probe in Verbindung mit der CO1-Barcodierung berücksichtigt werden.

Regeln für die Interpretation von Echtzeit-PCR-Ergebnissen von Proben mit Verdacht auf C. includens, C. chalcites oder C. eriosoma basierend auf Cq-Werten. 1Ein nicht eindeutiges Ergebnis ist wahrscheinlich auf eine unzureichende DNA-Menge oder eine schlechte DNA-Qualität zurückzuführen. 2Ein nicht eindeutiges Ergebnis ist wahrscheinlich auf Kontamination, Artefakte oder einen nicht abgetasteten Genotyp zurückzuführen. Bei Bedarf sollte eine 3CO1-Barkodierung durchgeführt werden, um zwischen C. chalcites und C. eriosoma abzugrenzen.

Die Artabgrenzung ist seit langem Gegenstand von Debatten unter Biologen (z. B. 49). Trotz des gelegentlich esoterischen Charakters dieser Debatten werden funktionelle Unterschiede häufig mit Artenbezeichnungen in Verbindung gebracht, einschließlich Schlüsselmerkmalen, die dazu führen können, dass eine Art eher invasiv ist als Geschwisterlinien (z. B. 50, 51). Bisher verwendete biologische und morphologische Methoden reichen nicht aus, um den taxonomischen Status von C. chalcites und C. eriosoma als eigenständige Arten zu bestimmen; Es scheint jedoch konsistente Unterschiede bei den genetischen Markern zu geben. Die Verwendung eines genetischen Artenkonzepts erfordert einen Diskurs darüber, welche molekularen Marker das beste Signal für die Artenerkennung liefern52,53. Zu den am häufigsten verwendeten Loci für Metazoen gehören ITS1 und ITS2, wobei Coleman22 darauf hindeutet, dass ITS2 immer für eine Art einzigartig ist, obwohl bekannt ist, dass es innerhalb der Art und sogar innerhalb von Individuen variiert26,27. Zwischen C. chalcites und C. eriosoma gibt es fünf SNVs und ein Indel in ITS1 und sechs SNVs in ITS2, beide innerhalb der beobachteten ribotypischen Variation für eine einzelne Art54. Als ITS1 von mehreren Individuen sequenziert wurde, erwiesen sich zwei der SNVs als variable Loci mit gemeinsamer Identität zwischen den beiden Arten. Murillo et al.36 vermuteten, dass die molekulare Variation zwischen den CO1-Barcodes von C. chalcites und C. eriosoma etwa 1 % betrug, was möglicherweise auf eine Synonymie hindeutet. Wir fanden heraus, dass die Variation zwischen beiden Arten für die ITS1-, ITS2- und CO1-Loci etwa 1 % betrug. Dies steht im Vergleich zur Variation zwischen diesen beiden Arten und C. includens, die für die gleichen Loci etwa 2,6 % betrug. Trotz der hohen Ähnlichkeit zwischen C. chalcites und C. eriosoma in den von uns durchgeführten phylogenetischen Analysen sind beide monophyletisch. Darüber hinaus beträgt die Jackknife-Unterstützung, die die beiden Arten trennt, sowohl für CO1 als auch für die vollständigen 45S-rDNA-Profile 100 % (Abb. 2A, ergänzende Abb. 4), während die Posterior-Wahrscheinlichkeit auf 0,82 sinkt, wenn nur ITS1 verwendet wird (Abb. 4A). Wenn eine Single Nucleotide Polymorphism (SNP)-Analyse mit CO1-Daten von C. chalcites und C. eriosoma mit einer minimalen Variantenhäufigkeit von 0,25 durchgeführt wird, gibt es 12 SNPs an 6 Loci, die die beiden trennen. Darüber hinaus unterstützen Artenabgrenzungstests die Hypothese, dass C. chalcites und C. eriosoma getrennte Arten sind, da sie beide wechselseitig monophyletisch sind und innerhalb jeder Gruppe einen unabhängigen evolutionären Antrieb zu haben scheinen. Angesichts dieser Ergebnisse können C. chalcites und C. eriosoma nach mehreren unterschiedlichen Konzepten als separate Arten betrachtet werden49. Der relativ geringe Abstand zwischen ihnen könnte darauf hindeuten, dass C. chalcites und C. eriosoma sich erst kürzlich auseinander entwickelt haben, seitdem aber getrennt geblieben sind, da in den rDNA- oder CO1-Daten keine Hinweise auf eine unvollständige Abstammungssortierung oder Introgression gefunden wurden. Eine umfassende geografische Probenahme bleibt jedoch für beide Arten eine Herausforderung, da nur wenige C. eriosoma in Museumssammlungen oder aus Fundstücken verfügbar sind und C. chalcites hauptsächlich aus invasiven Populationen entnommen wird. Ein schlüssiger Nachweis ihres phylogenetischen Status erfordert umfangreichere genetische und geografische Probenahmen.

Das Verbreitungsgebiet von C. eriosoma erstreckt sich von Hawaii bis Indien über die östliche Hemisphäre, während das Verbreitungsgebiet von C. chalcites ganz Afrika bis zur Mittelmeerregion Europas im Norden und bis nach Indien im Osten umfasst34,44. Dieses Verbreitungsmuster ähnelt dem anderer nachtaktiver Schädlinge (z. B. Spodoptera). Chrysodeixis chalcites scheint invasiver zu sein als C. eriosoma, da es in ganz Europa und Nordamerika Populationen außerhalb seines natürlichen Verbreitungsgebiets etabliert hat, während für C. eriosoma keine invasiven Populationen bekannt sind. Diese Populationen von C. chalcites überleben das ganze Jahr über in Gewächshäusern und scheinen relativ isoliert zu sein, da der genetische Abstand zwischen den Arten im Vergleich zu C. includens und C. eriosoma größer ist (Abb. 3A). Da die meisten verfügbaren Barcode-Daten für C. chalcites von Proben isolierter Populationen stammen, ist die molekulare Variation innerhalb des natürlichen Verbreitungsgebiets von C. chalcites unbekannt, was sich auf dessen Nützlichkeit für die Artenabgrenzung auswirkt55. Dies steht im Gegensatz zu C. eriosoma, das sich in zwei geografische Haplogruppen aufteilt und einen geringen genetischen Abstand zwischen den Arten aufweist (Abb. 2, 3A), sowie zu C. includens, das den niedrigsten genetischen Abstand zwischen den drei Arten aufweist . Chrysodeixis includens ist ausgesprochen panmiktisch, da die Populationen jedes Jahr nach Norden wandern28. In einer Studie über CO1- und CO2-Haplotypen in Brasilien untermauerten Silva et al.56 die Feststellung einer geringen Variabilität innerhalb von C. includens dort und fanden eine dominante Haplogruppe im ganzen Land.

Die biologischen und ökologischen Faktoren, die möglicherweise zu einer Divergenz zwischen C. chalcites und C. eriosoma führen, wurden nicht ausreichend beschrieben. Zusätzlich zu der Schwierigkeit, C. eriosoma von C. chalcites zu unterscheiden, basierte Kostrowickis40 Arbeit, in der er C. eriosoma von einem Synonym für C. chalcites abhob, auf der Grundlage der Flügelfärbung und der Genitalmorphologie, die beide nicht ausreichen, um diese Abstammungslinien zuverlässig zu diagnostizieren. Neuere Arbeiten zur Taxonomie von C. eriosoma und C. chalkites von Twinkle et al.42 haben wenig dazu beigetragen, die Beziehung zwischen ihnen zu untersuchen. Da die Hypothese einer einzelnen Art als reziprok monophyletisch, aber zufällig divergierend gilt, könnte die Gruppe als eine große Fisher-Wright-Population betrachtet werden48. Während es den Anschein hat, dass die beiden Arten bei getrennter Betrachtung unterschiedlich sind, kann das Gleiche auch für die verschiedenen Gruppen von C. acuta gesagt werden (Abb. 3; ergänzende Abb. 3). Dies ist bemerkenswert, da die in dieser Analyse verwendeten Sammelorte von C. acuta, ähnlich wie bei C. chalcites, nicht für das gesamte Verbreitungsgebiet repräsentativ sind, ein Faktor, der bekanntermaßen die Artenabgrenzungsanalysen verzerrt55.

Um einen diagnostischen Test für diese drei Arten zu entwickeln, ohne vollständige Genome für jede Art zu generieren, haben wir uns für die Sequenzierung der 45S-rDNA entschieden und die ITS1- und ITS2-Segmente zur Identifizierung verwendet. Diese Regionen mit hoher Kopienzahl eignen sich besonders gut für die molekulare Diagnostik, da die Sequenzen selbst in schlecht konservierten oder durch Umwelteinflüsse beschädigten Proben reichlich vorhanden sind25. Allerdings erschweren die Verwendung der PCR-Amplifikation zur Reduzierung der Sequenzierungseingabekomplexität und die Art der Nanoporensequenzierung, des Basecalling und der Kartierung die Klassifizierung der vollständigen ribotypischen Diversität von Individuen durch die Maskierung von in der DNA vorhandenen niederfrequenten Variationen26,57. Der für die Zusammenstellung verwendete Minimap-Algorithmus ermöglicht die Ausrichtung von Sequenzen, die bis zu 15 %58 variieren, was für die Verwendung mit verrauschten ONT-Daten wichtig ist, aber die Zuordnung von Lesevorgängen zu einer Referenzsequenz schließt Niederfrequenzschwankungen aus der endgültigen Zusammenstellung aus. Die Sequenzmontage wurde durch die Notwendigkeit einer progressiven Alignment-Technik zur Entwicklung der 45S-rDNA-Profile von C. includens und C. chalcites sowie der zum Zeitpunkt der Sequenzierung dieser Proben verfügbaren Basecalling-Software weiter erschwert, was beides zu Fehlern im Endergebnis führte Profile. Die C.-Includens-Daten wurden mit einem hochpräzisen (HAC) Modell ermittelt, während C. chalcites mit dem Schnellmodell geringerer Qualität ermittelt wurde. Die schlechtere Qualität des schnellen Algorithmus wurde deutlich, als C. eriosoma später mit einer neueren Version des HAC-Algorithmus sequenziert wurde und die vorhandenen Sequenzierungs- und Basecalling-Fehler durch einen Vergleich zwischen den beiden ansonsten sehr ähnlichen Sequenzen aufgedeckt wurden. Darüber hinaus weist die Nanopore-Technologie ein bekanntes Problem beim Lesen und Basecalling von G-Basen auf, insbesondere bei der Sequenzierung einer Zeichenfolge (3 oder mehr) von Gs59. Es überrascht nicht, dass Fehler in G-Wiederholungen das häufigste Problem im rDNA-Profil von C. chalcites waren, aber in den Profilen aller drei Arten vorhanden waren. Glücklicherweise ermöglichen ONT-Daten eine erneute Analyse von Sequenzdaten, um die Anrufgenauigkeit zu verbessern. Da sich die Nachbearbeitung für ONT verbessert, kann eine bessere Charakterisierung der ribotypischen Diversität mit hochpräzisen Basecalling-Modellen möglich sein. Zukünftig sollte die Einbeziehung weiterer Proben in die Sequenzierungsbemühungen eine verbesserte Erkennung inter- und intraspezifischer rDNA-Variationen ermöglichen und dazu beitragen, Artefakte zu identifizieren und zu beseitigen, die die effiziente Bindung der für die Artenerkennung konzipierten Oligos bei Verwendung einer Methode wie ddPCR stören könnten (siehe11). Der Vorteil der Reduzierung der Sequenzkomplexität mithilfe von PCR, ONT und den hier beschriebenen Assemblierungs- und Analysetechniken besteht darin, die häufigsten Motive für die Artenidentifizierung zu identifizieren. Diese Methode ermöglicht die schnelle Erstellung eines rDNA-Profils in einer Laborumgebung für schlecht untersuchte Arten für eine verbesserte Artendiagnostik. Darüber hinaus konnten wir mithilfe von LoFreq (Ergänzungstabelle 1) Ribotypen identifizieren, von denen wir die häufigsten durch Sanger-Sequenzierung bestätigen konnten (Ergänzungstabelle 1), die eine effiziente Primer- oder Sondenbindung beeinträchtigen und diese bei der Entwicklung vermeiden könnten der Echtzeit-PCR-Assay.

Aufgrund der Bedrohung, die C. chalcites und C. eriosoma für die US-Landwirtschaft darstellen, eignet sich eine Sonde, die Exemplare beider Arten identifiziert, wie sie hier entwickelt wurde, zum Screening von Verdächtigen, die in Fallen entdeckt oder an Einreisehäfen abgefangen werden. Eine Probe, die mithilfe des Echtzeit-PCR-Tests entweder als C. chalcites oder C. eriosoma identifiziert wurde, muss zu Berichtszwecken durch CO1-Barcode verifiziert werden. Umgekehrt wird C. includens häufig an Einreisehäfen in die USA abgefangen. Obwohl es in ganz Amerika vorkommt, sind die Larven schwer von anderen Plusiinae zu trennen, sodass eine Sonde, die C. includens erkennt, verwendet werden kann, um eine bessere Identifizierung zu ermöglichen und Verwirrung zu reduzieren mit exotischen Schädlingsarten. Beide diagnostischen Tests unterscheiden auch Chrysodeixis-Arten von anderen häufig abgefangenen oder gefangenen Plusiines, da der Multiplex-Assay bei Einhaltung der Identifizierungsregeln keine Off-Target-Amplifikation von Nicht-Zielarten zeigt.

Die molekulare Diagnostik spielt eine immer wichtigere Rolle bei der Identifizierung von Arten und der pflanzengesundheitlichen Sicherheit, auch bei Arten, für die nur wenige oder keine validierten Referenz-DNA-Sequenzdaten verfügbar sind. Diese rDNA-Sequenzierungsmethode kann aufgrund der Konservierung von 18S und 28S zwischen nahen Verwandten leicht an andere Abstammungslinien angepasst werden, indem die Primer verändert werden. In den meisten Fällen eignen sich die ITS-Regionen hervorragend für diagnostische Tests auf Artenebene und können für viele Arten von Proben und PCR-Modalitäten verwendet werden. Um die Beziehung zwischen C. chalcites und C. eriosoma zu klären, sind weitere Arbeiten erforderlich, einschließlich einer erweiterten Probenahme und Sequenzierung. Nach derzeitigem Stand reicht unser Echtzeit-PCR-Assay jedoch aus, um Proben für Quarantänezwecke zu diagnostizieren, und wird validiert Verwendung in anderen Laboreinrichtungen und auch für den Einsatz beim Massenscreening von Untersuchungsproben geeignet.

Ausgewachsene Exemplare und Larvenproben von C. includens und C. chalcites wurden an Waren an Einreisehäfen abgefangen und durch CO1-Barcoding8 unter Verwendung der Primer LepF1 und LepR1 (60; Tabelle 1), Genitaldissektion28, morphologische Identifizierungsschlüssel61 oder eine Kombination davon identifiziert Methoden. In dieser Studie wurden Larvenproben bestehend aus 58 C. includens- und 8 C. chalcites-Individuen von verschiedenen Standorten verwendet, die durch Abhörungen und Untersuchungen gewonnen wurden. Erwachsene Exemplare von C. eriosoma wurden in Hawaii mit Pheromonfallen gesammelt, die mit C. chalcites-Ködern (APHIS TL 17-065a) beködert waren, und für den Transport in Ethanol konserviert. Erwachsene wurden auch mittels CO1-Barcoding mit den Primern LepF1 und LepR1 identifiziert (Tabelle 1). Für diese Analyse wurden fünf Proben von C. eriosoma verwendet. Nicht zielgerichtete Tests wurden mit häufig gefangenen Plusiine-Arten aus den Vereinigten Staaten sowie abgefangenen Plusiine-Larven aus anderen Regionen durchgeführt, die oft mit Chrysodeixis-Arten verwechselt werden. Alle Proben wurden durch CO1-Barcode, Genitaldissektion oder beides identifiziert. Die Sanger-Sequenzierung, einschließlich CO1-Barcodierung, wurde von der DNA-Sequenzierungseinrichtung des Comprehensive Cancer Center der University of Chicago unter Verwendung eines DNA-Sequenziergeräts Applied Biosystems 3730XL (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) durchgeführt. Alle in dieser Studie verwendeten Ziel- und Nicht-Zielproben sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt.

Für Anwendungen, die keine hohe Qualität und Konzentration der DNA erfordern (z. B. DNA-Barcoding), wurde ein Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Für Anwendungen, die DNA mit höherer Qualität und Konzentration erfordern (z. B. Long-Range-PCR), wurde das Lucigen MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit (LGC Ltd, Teddington, Vereinigtes Königreich) gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einer zusätzlichen einstündigen Inkubation bei –20 °C verwendet °C vor der Fällung, um die DNA-Ausbeute zu erhöhen (siehe 10). Alle Proben wurden vor der Verwendung in Ethanol gelagert. Bei Larvenproben wurde jeweils ein kleiner Abschnitt vom hinteren Ende entnommen und in einem 1,5-ml-Röhrchen mit einem Stößel zermahlen und dann über Nacht in Lysepuffer inkubiert, wobei der verbleibende Teil der Extraktionstechniken am nächsten Tag durchgeführt wurde. Bei erwachsenen Proben wurden die Beine entfernt und von restlichem Ethanol befreit und dann in einem 1,5-ml-Röhrchen unter Verwendung von 1,4 mm Siliciumdioxid-/Zirkonoxidkügelchen in einem Mini-Beadbeater (BioSpec Products, Bartelsville, OK, USA) gemahlen. Mit beiden Methoden extrahierte DNA wurde in Puffer EB (Qiagen) eluiert, um die Kompatibilität mit PCR und Sequenzierung sicherzustellen. Die DNA-Konzentration wurde sowohl mit einem NanoDrop 2000-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) als auch mit einem Qubit 4.0-Fluorometer (Invitrogen, Waltham, MA, USA) unter Verwendung des Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert. Die gesamte DNA wurde bis zur Verwendung bei –20 ° C gelagert.

Da für jede Chrysodeixis-Art keine Genomsequenzdaten verfügbar sind, haben wir einen Satz allgemeiner Primer für Lepidopteren-rDNA (Tabelle 1) unter Verwendung eines Alignments (Ergänzungsdatei 2) der in Ergänzungstabelle 3 aufgeführten Sequenzen entworfen. Die Primer amplifizieren nahezu die gesamte rDNA-Region vom 5'-Ende von 18S bis zum 3'-Ende von 28S, eine Länge, die bei Schmetterlingsarten typischerweise zwischen 6500 und 7000 bp liegt (siehe Akzessionen aus der Ergänzungstabelle 3). Primer wurden mit Primer 3 v0.4.062,63 mit den folgenden Einstellungen entworfen: zweiwertige Kationen = 3,8 mM; einwertige Kationen = 50 mM; dNTPs = 0,8 mM mit der SantaLucia64-Formel zur Salzkorrektur und thermodynamischen Parametern. Primer wurden von IDT (Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA, USA) hergestellt. OligoCalc65 wurde zur Berechnung der salzbereinigten Schmelztemperaturen verwendet. Einzelne, mit Ethanol konservierte Larvenproben von C. includens und C. chalcites, die zuvor nicht für die DNA-Extraktion verwendet wurden, wurden verwendet, um DNA für die Langstrecken-PCR mit dem Lucigen MasterPure DNA and RNA Purification Kit zu gewinnen und durch CO1-Barcoding identifiziert. Dasselbe wurde mit zwei Beinen einer erwachsenen C. eriosoma-Probe durchgeführt. Insgesamt 30 ng DNA wurden zur Amplifikation mit dem Takara LR Taq Kit (TAKARA BIO INC., Kusatsu, Shiga, Japan) unter Verwendung von 600 nM jedes Primers (Tabelle 1), 5,0 µL Puffer und 8,0 µL dNTP-Mix verwendet und 0,5 µL Taq. Das verwendete PCR-Programm war wie folgt: 95 °C für 3 Minuten, gefolgt von 35 Zyklen mit 98 °C für 30 Sekunden, 51 °C für 30 Sekunden, 68 °C für 10 Minuten; und letzter Verlängerungsschritt bei 72 °C für 10 Minuten. Die gesamte PCR wurde mit einem Bio-Rad C1000 Touch Thermocycler (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) durchgeführt. Nach dem Thermocycling wurden die PCR-Produkte 3 Stunden lang auf einem 0,5 %igen Agarosegel bei 50 V laufen gelassen und auf einem UVP-GelSolo-Transilluminator (Analytik Jena AG, Jena, Deutschland) abgebildet. DNA von Helicoverpa armigera und H. zea wurde auch als PCR-Kontrolle verwendet, um sicherzustellen, dass die Primer wie vorgesehen funktionierten. Die PCR-Reinigung erfolgte durch Perlenreinigung mit paramagnetischen AMPure XP-Perlen (Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA) gemäß dem Arbeitsablauf des Herstellers. Die Fragmente wurden wie oben beschrieben mit einem Qubit 4.0 Fluorometer quantifiziert und bis zur Verwendung bei –20 °C gelagert.

Die Sequenzierung der Long-Range-PCR-Produkte wurde unter Verwendung eines MinION Mk1C mit MinION R9-Durchflusszellen (Oxford Nanopore Technologies; Oxford, UK) durchgeführt. Für die Bibliotheksvorbereitung wurde ein Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK110, Oxford Nanopore Technologies) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Nanoporen-Sequenzierungsreaktionen wurden 24 Stunden lang durchgeführt und live mit Mk1C oder nach dem Lauf in Guppy v. 6.1.2 (Oxford Nanopore Technology) mit einem Basecall versehen. Für jede Art wurden separate Bibliotheksvorbereitungen und Sequenzierungsreaktionen durchgeführt.

Nach der Sequenzierung wurde Epi2Me v3.4.2 (Oxford Nanopore Technologies) verwendet, um die Identität der DNA-Sequenzen in jeder Reaktion zu bestimmen. Sequenzen aus den während des Basecalling generierten Passdateien wurden dann als Sequenzlisten in Geneious Prime 2021 oder 2022 (https://www.geneious.com) importiert, die in 136 Pools mit jeweils 4000 Sequenzen für C. includens und 1825 Pools von unterteilt wurden Jeweils 4000 Sequenzen für C. chalcites und 1821 Pools mit jeweils 3500–4000 Sequenzen für C. eriosoma. Aus diesen wurden Fragmente der vorhergesagten Größe der rDNA jeder Art (basierend auf der Gelelektrophorese des PCR-Produkts) ausgewählt, die typischerweise etwa 10 % der gesamten Sequenzdaten für jede C. chalcites und C. eriosoma und etwa 25 % ausmachten. 30 % der gesamten Sequenzdaten für C. umfassen. Nach Größe sortierte Long-Read-Sequenzdaten für jede Art sind in GenBank unter der BioProject-ID PRJNA951779 verfügbar. Für C. chalcites und C. includens wurden Anfangssequenzen durch schrittweises Ausrichten der Sequenzen höchster Qualität aus den ersten Sätzen von Passdateien mit MUSCLE66 erhalten. Die verbleibenden Rohsequenzen wurden mithilfe des Minimap2-Plug-ins58 für Geneious Prime unter Verwendung des Pac-Bio/Oxford Nanopore-Datentyps und der Standardeinstellungen auf die von MUSCLE abgeleitete Konsensussequenz abgebildet. Um ein endgültiges rDNA-Profil für jede Art zu erhalten, wurden die Konsenssequenzen aus jeder Passdatei unter Verwendung von MUSCLE und MAFFT v 7.45067,68 unter Verwendung von Standardeinstellungen zum Vergleich miteinander abgeglichen. Da C. eriosoma zuletzt sequenziert wurde, wurden Passdateien aus diesem Sequenzierungslauf mithilfe von Minimap2 mit den oben genannten Einstellungen der endgültigen Konsenssequenz für C. chalcites zugeordnet. Endgültige Assemblierungen der für diese Studie generierten 45S-rDNA-Region finden Sie in der GenBank unter den Zugangsnummern OQ829604-OQ829607. Im endgültigen Alignment verbleibende Mehrdeutigkeiten wurden auf der Grundlage der Qualität und Art der einzelnen Mehrdeutigkeiten entweder als Sequenzierungsfehler oder als Ribotypen eingestuft (z. B. wurden Lücken oder Ns als Sequenzierungsfehler betrachtet, mehrdeutige Aufrufe, bei denen Sequenzvariationen an einem einzelnen Punkt grob auf zwei Basen aufgeteilt waren). über Konsensussequenzen hinweg wurden als Ribotypen betrachtet). Mehrdeutigkeiten, die Ribotypen darstellen, wurden mit LoFreq45 bestätigt, in etwa nach der Methode von Sultanov und Hochwagen69. Kurz gesagt, eine Teilmenge der größenselektierten Sequenzdaten für jede Art wurde mithilfe von Minimap2 mit dem Oxford Nanopore-Datentyp und den Standardeinstellungen an ihr jeweiliges endgültiges rDNA-Profil angepasst. Ausrichtungen wurden als .bam-Dateien exportiert und Varianten und Indels für jede wurden mit LoFreq aufgerufen. Die resultierenden „output.vcf“-Dateien wurden in Geneious importiert und auf die rDNA-Profile für jede Art abgebildet.

Aus den LoFreq-Ergebnissen wurden Varianten, die in ≥ 50 % der Sequenzen vorhanden waren, mithilfe der Sanger-Sequenzierung verifiziert, um nach heterozygoten Peaks zu suchen (Ergänzungstabelle 4). Insgesamt wurden vier Primersätze hergestellt, um vier mögliche Ribotyp-Loci in C. chalcites zu untersuchen, und drei Primersätze wurden entwickelt, um vier mögliche Ribotyp-Loci in C. includens zu untersuchen (Ergänzungstabelle 1). Für jede Art wurde ein endgültiger Konsens erstellt, der alle Passdateien und Unklarheiten umfasste, die nur biologisch abgeleitete Ribotypen darstellten, korrigiert, um gegebenenfalls Sanger-Sequenzierungsergebnisse widerzuspiegeln (Ergänzungsdatei 1). Die endgültigen rDNA-Profile für jede Art wurden miteinander abgeglichen, um sie bei der Entwicklung eines Echtzeit-PCR-Assays für jede Art zu verwenden.

Um die phylogenetischen Beziehungen zwischen den drei interessierenden Arten zu bestimmen, wurden verfügbare CO1-Daten aus der Barcode of Life Database (BOLD) heruntergeladen. Die Zugangsnummern und Sammelorte für die verwendeten Sequenzdaten sind in der Ergänzungstabelle 5 angegeben. Für diese Studie generierte Barcodes sind in GenBank unter den Zugangsnummern OQ732763-OQ732776 verfügbar. Nach der Qualitätskontrolle wurden die CO1-Sequenzen für alle drei Arten mithilfe von MAFFT v7.450 mit Standardeinstellungen abgeglichen. Alle Sequenzen wurden auf die gleiche Länge (494 bp) gekürzt. Eine Sequenz aus Helicoverpa zea oder drei Sequenzen aus H. armigera (Ergänzungstabelle 5) wurden ebenfalls als Fremdgruppen-Taxa einbezogen. Ein Bayes'scher Baum wurde mit dem MrBayes-Plugin70,71 für Geneious Prime unter Verwendung des GTR-Substitutionsmodells, einer MCMC-Kettenlänge von 1.100.000, einer Unterabtastfrequenz von 200 und einem 100.000-Baum-Burn-In mit einer uneingeschränkten Zweiglänge im Voraus generiert. Darüber hinaus wurde ein Neighbor Joining (NJ)-Baum mithilfe des Tamura-Nei-Distanzmodells72 ohne festgelegte Außengruppe und 1000 Jackknife-Replikate aufgelöst, um die Zweigunterstützung zu bewerten.

Zusätzlich zu CO1 haben wir Primer (unter Verwendung der oben genannten Parameter) entwickelt, um die ITS1-Region von Chrysodeixis zu amplifizieren, um die Auflösung dieser Kladen mithilfe der Zielsequenz für den Echtzeit-PCR-Assay zum Nachweis von C. chalkites zu testen. Die Platzierung des Vorwärtsprimers erfolgt innerhalb des 3′-Abschnitts von 18S und die Platzierung des Rückwärtsprimers innerhalb des 3′-Abschnitts von 5,8S, um eine gewisse Universalität der Primer für andere Schmetterlinge zu ermöglichen (Tabelle 1). Die ITS1-Region wurde dann aus einer Teilmenge unseres Archivs von Chrysodeixis-Larven und -Erwachsenen (3 Exemplare von C. includens, 11 Exemplare von C. chalcites und 5 Exemplare von C. eriosoma) sowie von H. zea amplifiziert, um als zu dienen eine Fremdgruppe. Die PCR wurde wie oben für CO1 beschrieben durchgeführt, jedoch mit 500 nM der Primer Chryso_ITS1_F und Chryso_ITS1_R (Tabelle 1) und dem folgenden Thermocycling-Programm: 95 °C für 3 Minuten; 40 Zyklen von 95 °C für 30 s, 58 °C für 30 s, 72 °C für 1 min; und 72 °C für 5 Min. Für diese Arbeit generierte ITS1-Sequenzen sind in GenBank unter den Zugangsnummern OQ780372-OQ780392 verfügbar. Aus diesen Daten wurde wie für CO1 beschrieben ein phylogenetischer Baum mit der oben beschriebenen Bayes'schen Analyse erstellt.

Beziehungen innerhalb und zwischen den drei Chrysodeixis-Arten wurden anhand von CO1- und ITS1-Sequenzdaten bewertet. Die statistische TCS-Sparsamkeitsanalyse wurde in PopART v1.7 (Population Analysis with Reticulate Trees73) verwendet, um Unterschiede zwischen Arten mithilfe beider Datensätze sowie zwischen Arten mithilfe von rDNA-Profilen einschließlich ribotypischer Diversität zu visualisieren. Die Artenabgrenzungsanalyse wurde mit dem Species Delimitation Plug-In für Geneious Prime46 durchgeführt, indem Gruppierungen aller drei Arten zusammen mit eng verwandten C. acuta aufgrund ihrer ähnlich breiten geografischen Verbreitung und reichlich verfügbaren CO1-Sequenzdaten verglichen wurden. Für diese Analyse wurde eine Teilmenge der zuvor verwendeten CO1-Sequenzen für jede Art aus BOLD und GenBank (Ergänzungstabelle 5) verwendet, um einen NJ-Baum wie oben beschrieben aufzulösen. Die Größe jeder Gruppe wurde reduziert, um ein Berechnungsartefakt zu vermeiden, das im Artenabgrenzungsprogramm vorhanden ist (Einzelheiten siehe 46, 48). Jeder der resultierenden internen Kladen wurde ausgewählt, um die Grenzen der aktuellen Chrysodeixis-Arten zu bestimmen.

Für jede interessierende Gruppe, C. includens und C. chalcites/C., wurde ein Satz Primer und eine Sonde entwickelt. Eriosom, basierend auf den oben generierten rDNA-Sequenzdaten (Tabelle 1; ergänzende Abbildung 5). Die Auswahl der ITS-Regionen erfolgte auf der Grundlage der Sequenzunähnlichkeit zwischen den beiden Kladen und zu anderen Lepidoptera sowie zur Vermeidung von Bereichen intragenomischer Sequenzvariation innerhalb der sequenzierten Individuen. Die zur Identifizierung ausgewählten Regionen lagen innerhalb von ITS2 für C. includens (ergänzende Abbildung 5A) und innerhalb von ITS1 für C. chalcites/C. Eriosom (Ergänzende Abb. 5B).

Die gesamte Echtzeit-PCR wurde auf einem Bio-Rad CFX96 Touch Echtzeit-PCR-System (Bio-Rad Laboratories Inc.) durchgeführt. Die Tests wurden für die Durchführung im Triplex-Verfahren mit gleichzeitiger Verwendung beider Diagnosesonden und einer Kontrollsonde (Tabelle 1) konzipiert. Der Kontrolltest wurde wie in Barr et al.23 beschrieben durchgeführt. Nach der Optimierung enthielt der endgültige Echtzeit-PCR-Mix 10 µL iTaq Universal Probes Master Mix (Bio-Rad Laboratories Inc.), 350 nM C. includens-Primer (includens_F und includens_R) und 175 nM C. includens-Sonde (includens_P). , 300 nM C. chalcites-Primer (chalcites_F und chalcites_R), 200 nM C. chalcites-Sonde (chalcites_P), 500 nM 18S-Kontrollprimer (RT_18S_F2 und RT_18S_R2) und 400 nM 18S-Kontrollsonde (RT_18S_P2) mit Wasser, um die Verdünnung abzuschließen der Mastermix und 1 µL DNA unterschiedlicher Konzentration oder zusätzliches Wasser für keine Gewebekontrollen (NTC). Das verwendete Thermocycling-Programm ist wie folgt: 3 Minuten bei 95 °C, anfängliche Denaturierung, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 20 Sekunden und 59 °C für 30 Sekunden mit Datenerfassung am Ende jedes Zyklus. Für alle Reaktionen wurden dünnwandige, weiße Hartschalen-PCR-Platten mit 96 Vertiefungen (Bio-Rad Laboratories Inc.) und optisch klaren Microseal „B“-Siegeln (Bio-Rad Laboratories Inc.) verwendet. Die Assay-Spezifität wurde anhand von 17 anderen häufig gefangenen oder abgefangenen Plusiine-Arten (Larven und adulte Tiere) getestet, die visuell mit C. includens, C. chalcites oder C. eriosoma verwechselt werden können (n = 67, Ergänzungstabelle 2). Die Schwellenwerte für jeden Primer-/Sondensatz wurden bestimmt, indem der Assay an 54 Proben von C. includens, 35 Proben von C. chalcites und 5 Proben von C. eriosoma durchgeführt wurde. Der Basisschwellenwert wurde für jede Sonde manuell auf 1000 RFU eingestellt.

Die Empfindlichkeit des Assays wurde bestimmt, indem drei technische Replikate serieller Verdünnungen von DNA aus C. includens, C. chalcites und C. eriosoma mit Konzentrationen von 10 ng/µL bis 1 × 10−6 ng/µL durchgeführt wurden. Der Assay wurde mit der Multiplex-Mischung der C. includens-, C. chalcites- und 18S-Kontroll-Primer/Sonden-Sets durchgeführt. Die Ergebnisse wurden angepasst, um den empirisch ermittelten RFU-Schwellenwert widerzuspiegeln, und die Cq-Werte wurden gemittelt und auf einer logarithmischen Skala mit der DNA-Konzentration verglichen, um die Steigung, den Y-Achsenabschnitt und die Korrelationseffekte der DNA-Konzentration auf die Assay-Empfindlichkeit gemäß Barr et al.23 zu bestimmen .

Nach Größe sortierte, nach Basen benannte Passdateien aus der ONT-Sequenzierung finden Sie unter der BioProject-Nummer PRJNA951779 für jede Art unter https://dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA951779?reviewer=vrpekj27ut9qv2i5qhe3f6b855. Sanger-Ergebnisse für CO1 und ITS1 finden Sie in der GenBank unter den Zugangsdaten OQ732763-OQ732776 bzw. OQ780372-OQ780392 sowie in den Zusatzinformationen. Elektropherogramme für Sanger-Ribotypprüfungen sind als ergänzende Abbildung 1 verfügbar. Alle anderen während der aktuellen Studie generierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Ricciardi, A. Sind moderne biologische Invasionen eine beispiellose Form des globalen Wandels? Konserv. Biol. 21, 329–336 (2007).

Artikel PubMed Google Scholar

Pyšek, P. et al. Warnung der Wissenschaftler vor invasiven gebietsfremden Arten. Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 95, 1511–1534 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R. & Morrison, D. Umwelt- und Wirtschaftskosten nicht einheimischer Arten in den Vereinigten Staaten. Bioscience 50, 53–65 (2000).

Artikel Google Scholar

McLaughlin, GM & Dearden, PK Invasive Insekten: Managementmethoden erforscht. J. Insect Sci. 19, 1–9 (2019).

Artikel Google Scholar

Gilligan, TM et al. Identifizierung von Heliothin-Larven (Lepidoptera: Noctuidae), die an US-Einreisehäfen aus der neuen Welt abgefangen wurden. J. Econ. Entomol. 112, 603–615 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Kelly, CL, Schwarzkopf, L., Gordon, IJ & Hirsch, B. Das Populationswachstum bleibt bei eingeführten Arten zurück. Ökologisch. Entwicklung 11, 4577–4587 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Madden, MJL et al. Verwendung von DNA-Barcodes zur Verbesserung der Identifizierung invasiver Schädlinge an US-Einreisehäfen. PLoS One 14, e0222291 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gilligan, TM et al. Ein Multiplex-Echtzeit-PCR-Assay zur Diagnose und Trennung von Helicoverpa armigera und H. zea (Lepidoptera: Noctuidae) in der Neuen Welt. PLoS One 10, e0142912 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Tembrock, LR, Farris, RE, Ledezma, L., Barr, NB & Gilligan, TM Ein Echtzeit-PCR-Assay zur Trennung von Autographa gamma (Noctuidae: Plusiinae) von morphologisch ähnlichen Arten in Nordamerika. J. Econ. Entomol. 110, 2609–2617 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zink, FA, Tembrock, LR, Timm, AE & Gilligan, TM Ein Echtzeit-PCR-Assay zur schnellen Identifizierung von Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae). J. Econ. Entomol. 113, 1479–1485 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Oliveira, TMR et al. Durch Assay-Optimierung kann die Empfindlichkeit der Echtzeit-PCR mit der ddPCR für den Nachweis von Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in Massenproben gleichgesetzt werden. Insekten 12, 885 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Zink, FA, Tembrock, LR, Timm, AE & Gilligan, TM Ein Duplex-ddPCR-Assay zum gleichzeitigen Nachweis von Ips sexdentatus und Ips typographus (Coleoptera: Curculionidae) in Massenfallenproben. Dürfen. J. Für. Res. 49, 903–914 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Mavridis, K. et al. Molekulardiagnostik der nächsten Generation (TaqMan qPCR und ddPCR) zur Überwachung der Insektizidresistenz bei Bemisia tabaci. Schädlingsbekämpfer Wissenschaft. 78, 4994–5001 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Roques, A. et al. Das Pflanzen europäischer Wächterbäume in Ostasien als neuartige Methode zur Identifizierung potenzieller Schädlingseindringlinge. PLoS One 10, e0120864 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Ratnasingham, S. & Hebert, PD BOLD: Das Barcode of Life Data System (http://www.barcodinglife.org). Mol. Ökologisch. Anmerkungen 7, 355–364 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sayers, EW et al. GenBank 2023-Update. Nukleinsäuren Res. 51, D141–D144 (2023).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hebert, PDN, Ratnasingham, S. & deWaard, JR Barcoding-Tierleben: Divergenzen der Cytochrom-C-Oxidase-Untereinheit 1 zwischen eng verwandten Arten. Proz. R. Soc. London. B (Ergänzung) 270, S96–S99. https://doi.org/10.1098/rsbl.2003.0025 (2003).

Artikel CAS Google Scholar

Brownlee, GG & Sanger, F. Nukleotidsequenzen aus der niedermolekularen ribosomalen RNA von Escherichia coli. J. Mol. Biol. 23, 337–353 (1967).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hillis, DM & Dixon, MT Ribosomale DNA: Molekulare Evolution und phylogenetische Folgerung. Q. Rev. Biol. 66, 411–453 (1991).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lane, DJ et al. Schnelle Bestimmung von 16S-ribosomalen RNA-Sequenzen für phylogenetische Analysen. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 82, 6955–6959 (1985).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jüttner, M. & Ferreira-Cerca, S. Blick durch die Linse der Evolutionsgeschichte der Ribosomenbiogenese: Mögliche Auswirkungen auf die archaische Phylogenie und Eukaryogenese. Mol. Biol. Entwicklung 39, msac054 (2022).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Coleman, AW Pan-Eukaryoten-ITS2-Homologien durch RNA-Sekundärstruktur aufgedeckt. Nukleinsäuren Res. 35, 3322–3329 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barr, NB, Ledezma, LA, Farris, RE, Epstein, ME & Gilligan, TM Ein Multiplex-Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionstest zur Diagnose von Epiphyas postvittana (Lepidoptera: Tortricidae). J. Econ. Entomol. 104, 1706–1719 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zink, FA et al. Ein Tröpfchen-Digital-PCR-Assay (ddPCR) zum Nachweis von Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in Massenfallenproben. PLoS One 12, e0178704 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Butterwort, V. et al. Eine DNA-Extraktionsmethode für Insekten aus Klebefallen: Bekämpfung eines Schädlings mit geringer Häufigkeit, Phthorimaea absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae), in gemischten Artengemeinschaften. J. Econ. Entomol. 115, 844–851 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Teruel, M. et al. Unterschiedliche molekulare Evolution zweier Arten repetitiver DNAs im Genom der Heuschrecke Eyprepocnemis plorans. Heredity (Edinb) 112, 531–542 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ganley, AR & Kobayashi, T. Hocheffiziente konzertierte Evolution in den ribosomalen DNA-Wiederholungen: Gesamtvariation der rDNA-Wiederholungen, aufgedeckt durch Shotgun-Sequenzdaten des gesamten Genoms. Genomres. 17, 184–191 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lafontaine, JD & Poole, RW Die Motten Amerikas nördlich von Mexiko, einschließlich Grönland-Faszikel 251 Noctuoidea: Noctuidae (Teil): Plusiinae (The Wedge Entomological Research Foundation, Paris, 1991).

Google Scholar

Specht, A., de Paula-Moraes, SV & Sosa-Gómez, DR Wirtspflanzen von Chrysodeixis umfassen (Walker) (Lepidoptera, Noctuidae, Plusiinae). Pfr. Fr. BHs. Entomol. Rev. 59, 343–345 (2015).

Artikel Google Scholar

Moonga, MN & Davis, JA Teilweise Lebensgeschichte von Chrysodeixis includens (Lepidoptera: Noctuidae) auf Sommerwirten. J. Econ. Entomol. 109, 1713–1719 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

de Sousa, PV et al. Bekämpfungsstrategien für Chrysodeixis und Spodoptera eridania-Raupen (Lepidoptera: Noctuidae) sowie Auswahl resistenter Sorten in Sojabohnen. Aust. J. Crop Sci. 13, 367–381 (2019).

Artikel Google Scholar

McQuate, GT & Sylva, CD Fang des erwachsenen grünen Gartengreifers Chrysodeixis eriosoma (Lepidoptera: Noctuidae) in Süßkartoffelfeldern auf Hawaii. Proz. Hawaii Entomol. Soc. 50, 43–53 (2018).

Google Scholar

Roberts, LIN Biologie von Chrysodeixis eriosoma (Lepidoptera: Noctuidae) in Neuseeland. Neuer Eifer. Entomol. 7, 52–58 (1979).

Artikel Google Scholar

Sullivan, M. & Molet, T. CPHST-Schädlingsdatenblatt für Chrysodeixis-Kalzite (USDA-APHIS-CPHST, 2007). Rev. Januar 2014. http://download.ceris.purdue.edu/file/3027

CABI. Chrysodeixis-Chalkite. Im Invasive Species Compendium (CAB International, 2022). http://www.cabi.org/isc

Murillo, H., Hunt, DWA & VanLaerhoven, SL Erste Aufzeichnungen von Chrysodeixis-Kalziten (Lepidoptera: Noctuidae: Plusiinae) für Ost-Zentral-Kanada. Dürfen. Entomol. 145, 338–342 (2013).

Artikel Google Scholar

Passoa, S. & Gilligan, TM Schädlingswarnung: Chrysodeixis chalcites (Esper) (Lepidoptera: Noctuidae) Golden Twin Spot (USDA-APHIS-PPQ, 1995). http://download.ceris.purdue.edu/file/96

NAPPO-Update zu Chrysodeixis sp. (Chalcites oder Eriosoma) Ausrottung in British Columbia, Kanada. Offizieller Schädlingsbericht 08. Mai 2007. https://www.pestalerts.org/official-pest-report/update-chrysodeixis-sp-chalcites-or-eriosoma-eradication-british-columbia (2007).

Leder, J. Chrysodeixis chalcites (Esper): Goldene Doppelfleckmotte. https://blogs.cdfa.ca.gov/Section3162/?p=2381 (2016).

Kostrowicki, AS Studien zu paläarktischen Arten der Unterfamilie Plusiinae (Lepidoptera: Phalaenidae). Acta Zool. Cracoviensia 6, 367–472 (1961).

Google Scholar

Holloway, JD, Bradley, JD & Carter, DJ CIE-Leitfäden zu Insekten von Bedeutung für den Menschen. I. Lepidoptera (CAB International, 1987).

Google Scholar

Twinkle, T., Shashank, PR & Chattopadhyay, PC-DNA-Barcoding und taxonomische Darstellung einiger ausgewählter Arten der Unterfamilie Plusiinae (Lepidoptera: Noctuidae) aus Indien. Zootaxa 4845, 451–486 (2020).

Artikel Google Scholar

Sarwar, ZM et al. Taxonomie und Verbreitung landwirtschaftlich wichtiger Plusiinae (Lepidoptera: Noctuidae) aus dem südlichen Punjab, Pakistan. Saudi J. Biol. Wissenschaft. 28, 5720–5727 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Lafontaine, JD & Schmidt, BC Ergänzungen und Korrekturen zur Checkliste der Noctuoidea (Insecta, Lepidoptera) Nordamerikas nördlich von Mexiko. Zookeys 264, 227–236 (2013).

Artikel Google Scholar

Wilm, A. et al. LoFreq: Ein sequenzqualitätsbewusster, hochempfindlicher Variantenaufrufer zum Aufdecken der Heterogenität von Zellpopulationen aus Hochdurchsatz-Sequenzierungsdatensätzen. Nukleinsäuren Res. 40, 11189–11201 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Masters, BC, Fan, V. & Ross, HA Species Delimitation – Ein geniales Plugin für die Erkundung von Artengrenzen. Mol. Ökologisch. Ressource. 11, 154–157 (2011).

Artikel PubMed Google Scholar

Rosenberg, NA Statistische Tests zur taxonomischen Unterscheidbarkeit anhand von Beobachtungen der Monophyse. Evolution 61, 317–323 (2007).

Artikel PubMed Google Scholar

Rodrigo, A. et al. Die Gefahren des Überflusses: Was machen wir mit all diesen Genen? Philos. Trans. R. Soc. London. B Biol. Wissenschaft. 363, 3893–3902 (2008).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

De Queiroz, K. Artenkonzepte und Artenabgrenzung. Syst. Biol. 56, 879–886 (2007).

Artikel PubMed Google Scholar

Colautti, R. et al. Quantifizierung der Invasivität von Arten. NeoBiota 21, 7–27 (2014).

Artikel Google Scholar

Huang, C. et al. Vorhersage der Invasivität von Insekten anhand von Sequenzierungsdaten des gesamten Genoms. Res-Platz (2020).

Fontaneto, D., Flot, J.-F. & Tang, CQ-Richtlinien für die DNA-Taxonomie, mit Schwerpunkt auf der Meiofauna. Mar. Biodivers. 45, 433–451 (2015).

Artikel Google Scholar

Dellicour, S. & Flot, JF Der Tramper-Leitfaden zur Abgrenzung einzelner Arten. Mol. Ökologisch. Ressource. 18, 1234–1246 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Kumar, V. et al. Die unerwartet hohe intragenomische Variation bei zwei der drei wichtigsten Thrips-Schädlingsarten hat keinen Einfluss auf die Nützlichkeit des ribosomalen internen transkribierten Spacers 2 (ITS2) zur Thrips-Identifizierung. Int. J. Mol. Wissenschaft. 18, 2100 (2017).

Artikel MathSciNet PubMed PubMed Central Google Scholar

Meyer, CP & Paulay, G. DNA-Barcoding: Fehlerraten basierend auf umfassender Stichprobe. PLoS Biol. 3, e422 (2005).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Silva, CS et al. Populationserweiterung und genomische Anpassung des Sojabohnen-Loopers an landwirtschaftliche Umgebungen. Chrysodeixis umfasst. Evol Appl 13, 2071–2085 (2020).

Artikel PubMed Google Scholar

Chen, W. et al. Eine hochwertige Genomassemblierung auf Chromosomenebene eines generalistischen Pflanzenfressers, Trichoplusia ni. Mol. Ökologisch. Ressource. 19, 485–496 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, H. Minimap2: Paarweise Ausrichtung für Nukleotidsequenzen. Bioinformatik 34, 3094–3100 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Delahaye, C. & Nicolas, J. DNA-Sequenzierung mit Nanoporen: Probleme und Vorurteile. PLoS One 16, e0257521 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hebert, PD, Penton, EH, Burns, JM, Janzen, DH & Hallwachs, W. Zehn Arten in einer: DNA-Barcoding enthüllt kryptische Arten im neotropischen Springfalter Astraptes fulgerator. Proc Natl Acad Sci USA 101, 14812–14817 (2004).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eichlin, TD & Cunningham, HB Zeichen zur Identifizierung einiger häufiger Plusiine-Raupen im Südosten der Vereinigten Staaten. Ann. Entomol. Soc. Bin. 62(3), 507–510 (1969).

Artikel Google Scholar

Koressaar, T. & Remm, M. Erweiterungen und Modifikationen des Primer-Designprogramms Primer3. Bioinformatik 23, 1289–1291 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Untergasser, A. et al. Primer3 – Neue Funktionen und Schnittstellen. Nukleinsäuren Res. 40, e115 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

SantaLucia, J. Jr. Eine einheitliche Sicht auf die Thermodynamik des nächsten Nachbarn von Polymer-, Hantel- und Oligonukleotid-DNA. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 95, 1460–1465 (1998).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kibbe, WA OligoCalc: Ein Online-Rechner für Oligonukleotideigenschaften. Nukleinsäuren Res. 35, W43–W46 (2007).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Edgar, RC MUSCLE: Mehrfachsequenz-Alignment mit hoher Genauigkeit und hohem Durchsatz. Nukleinsäuren Res. 32, 1792–1797 (2004).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Katoh, K., Misawa, K., Kuma, K. & Miyata, T. MAFFT: Eine neuartige Methode für die schnelle Ausrichtung mehrerer Sequenzen basierend auf der schnellen Fourier-Transformation. Nukleinsäuren Res. 30, 3059–3066 (2002).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Katoh, K. & Standley, DM MAFFT Multiple Sequence Alignment Software Version 7: Verbesserungen bei Leistung und Benutzerfreundlichkeit. Mol. Biol. Entwicklung 30, 772–780 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sultanov, D. & Hochwagen, A. Unterschiedliche Selektionsstärken tragen zur intragenomischen Vielfalt der rRNA-Gene bei. Nat. Komm. 13, 7245 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huelsenbeck, JP & Ronquist, F. MRBAYES: Bayesianische Folgerung phylogenetischer Bäume. Bioinformatik 17, 754–755 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ronquist, F. & Huelsenbeck, JP MrBayes 3: Bayesianische phylogenetische Inferenz unter gemischten Modellen. Bioinformatik 19, 1572–1574 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tamura, K. & Nei, M. Schätzung der Anzahl von Nukleotidsubstitutionen in der Kontrollregion der mitochondrialen DNA bei Menschen und Schimpansen. Mol. Biol. Entwicklung 10, 512–526 (1993).

CAS PubMed Google Scholar

Clement, M., Posada, D. & Crandall, KA TCS: Ein Computerprogramm zur Schätzung von Gengenealogien. Mol. Ökologisch. 9, 1657–1659 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken Charlotte Aldebron, Silvana Paula-Mores und Julieta Brambila für ihre Bemühungen, Ziel- und Nichtzielproben für diese Studie zu erhalten. Wir danken Maiki Vlahinos auch für den Zugang zur notwendigen Computerausrüstung. Diese Studie wurde teilweise durch eine Kooperationsvereinbarung des Tier- und Pflanzengesundheitsinspektionsdienstes des US-Landwirtschaftsministeriums (Kooperationsvereinbarungen AP21PPQS&T00C047 und AP20PPQS&T00C012) ermöglicht; es spiegelt möglicherweise nicht unbedingt die Ansichten von APHIS wider. Bilder von C. chalcites und C. includens wurden von Todd M. Gilligan aufgenommen und das Bild von C. eriosoma ist über Creative Commons erhältlich. Wir danken auch den drei anonymen Gutachtern für ihre Kommentare, die die Qualität dieses Manuskripts erheblich verbessert haben.

Abteilung für Agrarbiologie, Colorado State University, Fort Collins, CO, USA

Frida A. Zink, Luke R. Tembrock und Alicia E. Timm

Labor für Schädlingsidentifizierungstechnologie, USDA-APHIS-PPQ-Science and Technology, Fort Collins, CO, USA

Todd M. Gilligan

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Die FAZ konzipierte und gestaltete die Studie, führte die Laborarbeiten und Datenanalysen durch und verfasste den Manuskriptentwurf; LRT konzipierte die Studie, überwachte phylogenetische und phylogeografische Analysen und gab erste Kommentare zu den Entwürfen ab; AET steuerte Proben bei, identifizierte Proben und stellte DNA-Extrakte für die Barcode-Kennzeichnung und ITS1-Sequenzierung bereit; TMG überwachte das Projekt und leistete morphologische Beratung; Alle Autoren haben die endgültige Fassung des Manuskripts gelesen und dazu beigetragen.

Korrespondenz mit Luke R. Tembrock.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Zink, FA, Tembrock, LR, Timm, AE et al. Ultratiefe Sequenzierung von 45S-rDNA zur Erkennung der intragenomischen Diversität in drei Chrysodeixis-Arten zur molekularen Identifizierung. Sci Rep 13, 13017 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39673-7

Zitat herunterladen

Eingegangen: 24. März 2023

Angenommen: 28. Juli 2023

Veröffentlicht: 10. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39673-7

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.