Onkologieforscher: Holen Sie das Beste aus Ihren digitalen PCR-Daten heraus?

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Krebs kann sich scheinbar im Handumdrehen verändern, was die Erkennung und Überwachung äußerst zeitkritisch macht. Für schnelle, empfindliche und genaue Tests auf Tumor-DNA setzen Krebsforscher zunehmend auf die digitale PCR (dPCR). Allerdings gibt es bei der Durchführung dieser Messungen kaum Spielraum für Fehler. Hier diskutieren wir, wie gute dPCR-Daten aussehen, wie minderwertige Geräte die Datenqualität beeinträchtigen können und was Onkologieforscher tun können, um qualitativ hochwertige dPCR-Daten zu erhalten, die genaue und effiziente Einblicke in die Tumorlast ermöglichen.

Bei vielen Krebsarten gilt: Je früher die Behandlung beginnt, desto größer ist das Behandlungsfenster und desto wahrscheinlicher ist es, dass ein Patient überlebt. Abhängig von der genetischen Ausstattung eines Tumors können jedoch einige Behandlungen wirksamer sein als andere. Die Sequenzierung der nächsten Generation kann die Auswahl einer geeigneten Behandlung beschleunigen, indem sie molekulare Biomarker im Tumor identifiziert, die die Krankheit auslösen oder ihn medikamentenresistent machen.

Anschließend erforschen viele Forscher den Einsatz einer nichtinvasiven Technik namens Flüssigbiopsie, um diese Biomarker zu verfolgen. Diese Technik beurteilt zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA), um Biomarker im Blut und anderen Körperflüssigkeiten zu messen. Flüssigbiopsiedaten können Aufschluss über die Tumorlast geben, Aufschluss über die Prognose geben und Behandlungsentscheidungen darüber leiten, wann und wie lange eine ausgewählte Therapie verabreicht werden soll. Diese Erkenntnisse haben ein erhebliches Potenzial, um in Zukunft eine wirksamere, personalisierte Krebsbehandlung zu ermöglichen.

ctDNA kommt in Flüssigbiopsieproben in winzigen Mengen vor, daher ist der Einsatz hochempfindlicher Technologien wie dPCR von entscheidender Bedeutung, um genaue Ergebnisse zu gewährleisten. Wenn man jedoch die zahlreichen verfügbaren dPCR-Systeme vergleicht, erzeugen unterschiedliche Gerätedesigns Daten unterschiedlicher Präzision, Genauigkeit und Empfindlichkeit. Inkonsistente Daten untergraben die überwältigenden Erfolge der gesamten Biomarkerforschung. Damit die Flüssigbiopsie schließlich zum Standard-Klinikeinsatz wird, benötigen Onkologieforscher Werkzeuge und Reagenzien, die zuverlässig Biomarkerdaten in höchster Qualität liefern.

Alle dPCR-Ansätze sind darauf ausgelegt, äußerst genaue und präzise Nukleinsäuretests zu ermöglichen und eine absolute Quantifizierung der Zielspezies zu ermöglichen. Bei einem dPCR-Assay wird eine Probe in Tausende separate Einheiten aufgeteilt, von denen jede einen oder mehrere DNA-Stränge enthält. Dies kann auf einem Microarray, auf einem Mikrofluidikchip, in quantitativen PCR-ähnlichen Mikrofluidikplatten oder im Fall der Droplet Digital PCR (ddPCR) in einer Öl-Wasser-Emulsion erfolgen. Als nächstes findet in jeder Partition eine PCR-Reaktion statt und fluoreszierende Sonden amplifizieren die Zielnukleinsäure. Am Ende der Reaktion werden die Partitionen auf positive oder negative Fluoreszenz untersucht. Forscher nutzen die Poisson-Statistik, um die Konzentration der Zielnukleinsäure in der Originalprobe zu bestimmen.

Im Gegensatz zur quantitativen PCR (qPCR) müssen Forscher bei dPCR-Assays ihre Proben nicht entlang einer Standardkurve laufen lassen, um die Ergebnisse zu interpretieren, wodurch die Möglichkeit menschlicher Fehler verringert wird. Es ermöglicht außerdem die hohe Empfindlichkeit und die hohe Nachweisgrenze von dPCR-Assays, wodurch sie in der Lage sind, Proben zu beurteilen, die weniger als ein Prozent einer Zielspezies enthalten – was bei Flüssigbiopsieproben häufig der Fall ist.

Wie bei jeder Technologie beeinflussen die Art des Instruments, die Qualität der Reagenzien und die Fähigkeiten des Benutzers die Zuverlässigkeit einer mit dPCR beurteilten Flüssigbiopsie. Da bestimmte Elemente von dPCR-Instrumenten und -Assays variieren, liefern nicht alle Instrumente Daten in der gleichen Qualität. Während es vorzuziehen ist, ein System zu wählen, das Ergebnisse zu geringen Kosten, mit einem einfachen Arbeitsablauf und einer kurzen Zeit von der Probe bis zum Ergebnis liefert, müssen Forscher auch die Qualität des ctDNA-Tests priorisieren, um ein Instrument auszuwählen, das ihrer Forschung echte Erkenntnisse liefert.

Fazit: Forscher können nur dann auf Biomarker-Daten reagieren, wenn sie den Ergebnissen ihrer dPCR-Assays vertrauen können. Wie sehen also gute Daten aus?

dPCR-Daten sollten binär sein, was bedeutet, dass positive und negative Punkte in einem Diagramm durch einen Schwellenwert klar getrennt sind (Abbildung 1). Schlechte dPCR-Datensätze weisen eine schlechte Trennung zwischen positiven und negativen Partitionen auf und können viel Rauschen aufweisen, was die Festlegung eines Schwellenwerts schwierig macht. Schlechte Daten können verschiedene Ursachen haben, beispielsweise ein fehlerhafter Test oder ein fehlerhaftes Gerät oder ein Inhibitor, der den Test beeinträchtigt. Wenn dies geschieht, muss der Forscher den Test wiederholen, was die äußerst zeitkritische Information darüber, wie ein Tumor auf die Behandlung reagiert, verzögert und zusätzliches Geld kostet.

Gute Daten

Schlechte Daten

Schlechte Daten erscheinen in verschiedenen Formen, die Aufschluss über die Ursache des Problems geben können (Abbildung 2). Der Versuch, diese Art von Daten zu interpretieren, birgt ein hohes Risiko einer ungenauen Quantifizierung.

● Zufällige positive Partitionen erscheinen im Diagramm verstreut wie Regen. Dieses Problem tritt auf, wenn das Ziel DNA über Partitionen hinweg mit variabler Rate amplifiziert hat. Dies kann auf einen Assay mit geringer Spezifität, eine schlechte Probenaufteilung oder Geräterauschen hinweisen. Da positive und negative Partitionen miteinander verschmelzen, ist es nicht einfach, einen Schwellenwert festzulegen, der die Nachweisgrenze verringert.

● Hardware-Instabilität kann zu inkonsistenten Amplituden innerhalb positiver und negativer Partitionen führen, sodass unklar ist, wo der Schwellenwert gezogen werden soll. Ein erfahrener Benutzer muss versuchen, den Schwellenwert zu zeichnen und die Ergebnisse manuell zu interpretieren, um einen Sinn aus den Ergebnissen zu ziehen. Dies birgt jedoch die Möglichkeit menschlicher Fehler und verringert dadurch die Empfindlichkeit.

● Rauschen und optische Instabilität führen dazu, dass sich Daten mit negativen Datenpunkten oberhalb des Schwellenwerts anhäufen. Diese Art von Daten resultiert normalerweise aus Blasen, festen Verunreinigungen oder optischen Problemen mit dem Instrument. Auch hier kann ein gut geschulter Benutzer diese Ergebnisse manuell interpretieren, aber der Prozess nimmt wertvolle Zeit des Forschers in Anspruch und führt zu menschlichem Versagen, was die Empfindlichkeit des Tests verringert.

● Eine Kreuzkontamination tritt auf, wenn die Ziel-DNA von einer Partition in eine benachbarte wandert. Dieses Problem kann durch Benutzerfehler, Umgebungsfaktoren oder durch das Gerät selbst verursachte Probenstreuung verursacht werden. Eine Kreuzkontamination führt dazu, dass negative Partitionen wirklich positiv erscheinen, sodass es unmöglich ist, den Ergebnissen zu vertrauen. Forscher können möglicherweise feststellen, ob eine Kreuzkontamination ihre Tests beeinflusst hat, indem sie sich die No-Template-Kontrollen ansehen, die keine positiven Datenpunkte liefern sollten. Besonders anfällig für dieses Problem sind dPCR-Assays, die auf Mikroarrays und Plattenchips durchgeführt werden, während dies bei ddPCR-Assays, die in Öl-Wasser-Emulsionen durchgeführt werden, nicht der Fall ist.

Vielversprechende Forschungsbereiche zielen darauf ab, ctDNA-Tests während der gesamten Krebsbehandlung einzusetzen: während der neoadjuvanten Therapie zur schnellen Beurteilung des Tumorstatus und der Arzneimittelwirksamkeit, nach kurativen Eingriffen zur Messung der verbleibenden Tumorlast und während der Langzeitüberwachung, um ein Wiederauftreten des Tumors so früh wie möglich zu erkennen . Damit diese Forschung ungehindert voranschreiten und zum Standard in der klinischen Versorgung werden kann, ist es entscheidend, Technologien einzusetzen, die Daten höchster Qualität generieren, um den Nutzen jedes dieser Ansätze zu bestimmen.

Durch den Einsatz hochwertiger Instrumente, Reagenzien und Methoden zur Weiterentwicklung ihrer Arbeit können Onkologieforscher zuversichtlich vorgehen und mit der zeitkritischen Natur der Krebsbehandlung Schritt halten. Auf diese Weise können sie sicherstellen, dass ihre Arbeit den Versorgungsstandard zukünftiger Krebspatienten kontinuierlich verbessert.