Einfluss von Sulfid auf das diazotrophe Wachstum des Methanogens Methanococcus maripaludis und seine Auswirkungen auf die Entstehung der Nitrogenase

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 799 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Methanogene leben in euxinischen (sulfidreichen) oder eisenhaltigen (eisenreichen) Umgebungen, die die Ausfällung von Übergangsmetallen als Metallsulfide wie Pyrit fördern und so die Verfügbarkeit von Metallen oder Schwefel verringern. Solche Umgebungen waren in der gesamten Erdgeschichte häufig anzutreffen, was die Frage aufwirft, wie Anaerobier diese Elemente für die Synthese von Enzym-Cofaktoren erhalten. Hier zeigen wir, dass ein Methanogen Molybdän-Nitrogenase-Metallocofaktoren aus Pyrit als Eisen- und Schwefelquelle synthetisieren kann, was die Stickstofffixierung ermöglicht. Mit Pyrit gezüchtete, stickstofffixierende Zellen wachsen schneller und benötigen 25-mal weniger Molybdän als Zellen, die unter euxinischen Bedingungen gezüchtet wurden. Die Wachstumserträge sind in Kulturen, die unter eisenhaltigen Bedingungen gezüchtet werden, drei- bis achtmal höher als unter euxinischen Bedingungen. Physiologische, transkriptomische und geochemische Daten deuten darauf hin, dass diese Beobachtungen auf eine durch Sulfide geförderte Metallbeschränkung, insbesondere Molybdän, zurückzuführen sind. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Molybdän-Nitrogenase möglicherweise aus einer eisenhaltigen Umgebung stammt, in der Sulfid zu Pyrit titriert wurde, was die Verfügbarkeit von ausreichend Eisen, Schwefel und Molybdän für die Cofaktor-Biosynthese erleichterte.

Stickstoff (N) ist für die Synthese von Nuklein- und Aminosäuren sowie anderen wichtigen Biomolekülen in allen Lebensformen unerlässlich. Das größte N-Reservoir der Erde ist das Gas Distickstoff (N2) in der Atmosphäre; Es ist jedoch nicht bioverfügbar und muss vor seiner Assimilation an Nitrat (NO3-) oder Ammoniak (NH3) gebunden werden. Daher schränkt die Verfügbarkeit von festem N häufig die Produktivität von Ökosystemen ein1. Auf der frühen Erde wird fester Stickstoff vermutlich durch abiotische Prozesse wie die blitzbasierte Oxidation von atmosphärischem N2 oder die mineralische Reduktion von N22,3 bereitgestellt. Der feste N-Gehalt aus diesen Quellen wäre jedoch minimal und endlich gewesen, und zusammengenommen wird davon ausgegangen, dass diese Merkmale in dieser Zeit nur eine begrenzte Ökosystemproduktivität aufweisen1. Heutzutage werden etwa 50 % des gesamten fixierten N durch den biologischen Prozess der N2-Fixierung1,4 erzeugt, wobei N2 durch das Enzym Nitrogenase (Diazotrophie) zu NH3 reduziert wird, während der verbleibende fixierte N größtenteils durch den industriellen Haber-Bosch-Prozess erzeugt wird.

Bisher wurden drei verschiedene Formen der Nitrogenase beschrieben, die sich durch die (Hetero-)Metalle unterscheiden, die das aktive Zentrum jedes Enzymkomplexes bilden5. Dazu gehören reine Molybdän- (Mo), Vanadium- (V) und Eisen- (Fe) Formen der Nitrogenase6,7. Mo-Nitrogenase (Nif) ist taxonomisch die am weitesten verbreitete und älteste Form der Nitrogenase8,9 und besteht mindestens aus den Strukturproteinen NifHDK und den Maturaseproteinen NifB(E)N10. Der Metallcluster des aktiven Zentrums von Nif besteht aus einem Kern aus sechs Eisen- (Fe) und neun Schwefelatomen (S), wobei Fe symmetrisch ein zentrales Kohlenstoffatom koordiniert; Der Metallcluster ist von Fe- und Mo-Atomen [7Fe-Mo-9S] (als FeMo-Cofaktor bezeichnet) bedeckt10,11). Zusätzlich zu FeMo-Cofaktor(en) benötigt Nif den komplexen P-Cluster, der aus acht Fe-Atomen und sieben S-Atomen [8Fe-7S]12 besteht. In jedem NifD-Strukturprotein ist ein FeMo-Cofaktor untergebracht, während sich der P-Cluster an der Schnittstelle von NifD und NifK befindet und letztendlich das Heterotetramer NifD2K213 bildet. Die Dinitrogenase-Reduktase NifH moduliert den ATP-abhängigen Elektronentransfer zu NifD2K2 und beherbergt einen zusätzlichen [4Fe-4S]-Cluster für jede der beiden NifH-Untereinheiten14,15. Daher haben Zellen, die eine N2-Fixierung über Nif durchführen, einen hohen Bedarf an Fe, S, Mo, ATP und reduzierenden Äquivalenten.

Phylogenetische Analysen einer Verkettung von NifHDK-Proteinen weisen darauf hin, dass die frühesten sich entwickelnden Abstammungslinien von Nif in hydrotrophen Methanogenen zu finden sind6,7,8,9,16,17. Diese Beobachtungen werden durch andere Daten bestätigt, die darauf hinweisen, dass sich NifHDK aus einer Reihe von Duplikationen von Genen entwickelt hat, die einen Vorfahren von CfbCD8 kodieren, Proteine, die für die Synthese des Cofaktors F43018,19 erforderlich sind. Dass F430 (und CfbCD-kodierende Gene) ausschließlich in archaealen Methanogenen (und archaealen Alkanotrophen)20 vorkommen, ist ein weiterer Beweis dafür, dass Nif unter den Vorfahren dieser Archaeen ihren Ursprung hat. Diese Daten wurden verwendet, um einen Ursprung von Nif bei einem Vorfahren anaerober Methanogene während des mittleren Paläoproterozoikums vor etwa 1,8–2,1 Milliarden Jahren (Ga)6,9,17 vorzuschlagen, obwohl Isotopendaten der in Schiefern konservierten organischen Materie auf > datiert wurden 3 Ga deuten auf einen noch früheren Ursprung hin21,22. Unabhängig vom tatsächlichen Entstehungsdatum wird Nitrogenase als ein uraltes Enzym interpretiert, das in einer anoxischen Umgebung auf der frühen Erde entstand. Ein anoxischer Ursprung dieses Enzyms steht im Einklang mit der Sauerstoffempfindlichkeit der für die Nif-Funktion erforderlichen Metallcluster23. Nif diversifizierte sich dann unter Anaerobiern und wurde erst spät in seiner Evolutionsgeschichte durch horizontalen Gentransfer zwischen Organismen erworben, die in der Lage waren, Sauerstoff (O2) in ihren Energiestoffwechsel zu integrieren oder im Fall von Cyanobakterien O2 zu produzieren. Eine erhöhte biologische Produktivität im Zusammenhang mit der Vermehrung von Cyanobakterien und der O2-Produktion hätte die Nachfrage nach bestehenden abiotischen Pools an fixiertem N24 erhöht, was möglicherweise der selektive Druck zur Entwicklung eines biologischen Mechanismus zur Reduzierung von atmosphärischem N2 und zur Entlastung der N-Limitierung gewesen sein könnte7,25.

Eisenhaltige Bedingungen (anoxisch und eisenhaltiges Eisen (Fe(II))) dominierten wahrscheinlich die anoxischen Umgebungen während des Archaikums (>2,4 Ga)26,27. Dies ist auf die Zirkulation hydrothermaler Flüssigkeiten durch eisenreiche Basalte im mittleren Ozean zurückzuführen, die dazu führte, dass eine größere Menge Fe(II) in anoxische Gewässer des Ozeanbeckens gelangte als Sulfid (HS-)28. Ohne Sauerstoff wäre der Überschuss an Fe(II) stabil gewesen, und die Konzentrationen an freiem Fe(II) lägen schätzungsweise zwischen 0,05 und 0,5 mM29. Die Vermehrung von Cyanobakterien und die Produktion von O2 während des späten Archaikums führten jedoch zu einer oxidativen Verwitterung kontinentaler Sulfidminerale, die den Sulfatfluss in die Ozeane erhöhte. In Kombination mit einer erhöhten Produktivität in der Nähe der Meeresränder30,31 hätte dies die heterotrophe Sulfatreduktion und die HS-Produktion stimuliert. Dies wiederum führte zu geschichteten Küstenmeeren, die an der Oberfläche mit Sauerstoff angereichert waren und in der Tiefe euxinisch (anoxisch und HS-reich) waren30,31,32. Im Gegensatz dazu blieben tiefere Meeresgewässer und solche weiter entfernt von den Kontinentalrändern eisenhaltig26, was auf eine geringere Produktivität in der darüber liegenden Wassersäule, eine geringere Verfügbarkeit von Sulfat und eine anschließende heterotrophe Sulfatreduktion sowie einen hydrothermischen Eintrag von Fe26,33,34 zurückzuführen ist. HS- hat eine hohe Affinität zu Fe(II), was zur Bildung von Eisensulfidmineralien mit geringer Löslichkeit führt, einschließlich Pyrit (FeS2)35,36,37. Daher übersteigen in euxinischen Umgebungen die Konzentrationen von HS- die von Fe(II), was zur Titration und Ausfällung von Fe(II) als FeS2 führt. Unter diesen Bedingungen steht überschüssiges HS- auch zur Komplexierung mit anderen thiophilen Metallen (z. B. Mo, Co, Ni) zur Verfügung, wodurch diese möglicherweise weniger bioverfügbar sind33,34,38.

Wie könnten N2-fixierende Methanogene ihren gleichzeitigen Bedarf an Fe, S und Mo für die Synthese von Nif-Cofaktoren während des Paläoproterozoikums oder sogar früher gedeckt haben, als eines oder mehrere dieser Elemente aufgrund der Tendenz dazu wahrscheinlich nur begrenzt verfügbar waren? Metallsulfidbildung? Mögliche Anhaltspunkte ergeben sich aus aktuellen Studien über zeitgenössische Methanogene, insbesondere Methanococcus voltae und Methanosarcina barkeri, die ihre Fähigkeit aufzeigen, FeS2 reduktiv aufzulösen und Auflösungsprodukte zu nutzen, um den Nährstoffbedarf an Fe und S zu decken39,40,41. Mit FeS2 gezüchtete M. voltae und M. barkeri hatten ähnliche Wachstumsraten und Zellerträge im Vergleich zu herkömmlichen Fe- und S-Quellen, die zum Züchten von Methanogenen (Fe(II) und HS- und/oder Cystein) verwendet wurden39,40. Diese Experimente wurden jedoch an nicht N2-fixierenden Methanogenzellen durchgeführt, von denen man erwarten würde, dass sie einen geringeren Bedarf an Fe, S und Mo haben als solche, die aktiv N2 fixieren, insbesondere solche, die mit Mo-Nitrogenase wachsen. Solche Beobachtungen deuten darauf hin, dass eisenhaltige Bedingungen für die Entstehung und frühe Verbreitung von Nif möglicherweise günstiger sind als euxinische Bedingungen.

Hier wollten wir die Wirkung von euxinischen und eisenhaltigen Bedingungen auf das Wachstum und die Aktivität des Methanogens Methanococcus maripaludis S2 (MmS2) bewerten, um neue Erkenntnisse über den Umgebungstyp zu gewinnen, der für die Entstehung von Nif am förderlichsten ist. Zellen wurden zunächst mit Fe(II) und HS- oder FeS2 als primäre Fe- und S-Quelle unter N2-fixierenden oder NH3-veränderten Bedingungen gezüchtet, um festzustellen, ob FeS2 als Fe- und S-Quelle für die Biosynthese der Nitrogenase dienen könnte und um zu bestimmen ob HS- die Mo-Beschränkung antreibt. Die Kultivierungstests konzentrierten sich dann auf mit FeS2 gezüchtete Zellen, da diese Bedingung die Einbeziehung von überschüssigem Fe(II) oder HS- in das Kultivierungsmedium ermöglicht und so eine Bewertung der Auswirkung von eisenhaltigen bzw. euxinischen Bedingungen auf die Metallverfügbarkeit ermöglicht N2-Fixierungsaktivität. Nif ist die einzige in MmS242 kodierte Nitrogenase und mildert die Störvariable, die mit dem Wechsel von Zellen zu neueren und alternativen Formen der Nitrogenase (d. h. Fe-Nitrogenase Anf; V-Nitrogenase, Vnf9) verbunden ist, wenn oder wann Mo limitierend wird5,43 . Darüber hinaus gehört das von MmS2 kodierte Nif zur frühesten sich entwickelnden Linie der Nitrogenase6,8,9,16. Um zusätzliche Mo-Anforderungen an MmS2 zu stellen, wurden Zellen mit Formiat gezüchtet, was die Expression der Molybdopterin-haltigen Formiatdehydrogenase44,45 und der Mo- oder Wolfram (W)-abhängigen Formylmethanofuran-Dehydrogenase (Fmd bzw. Fwd)46,47 erforderte. Die Ergebnisse werden in Bezug auf die potenziellen Umweltbedingungen (d. h. euxinisch oder eisenhaltig) diskutiert, die es dem O2-empfindlichen Nif-Enzym ermöglicht hätten, sich in einem Methanogen und letztlich auch anderen Anaerobiern in den anoxischen Lebensräumen der frühen und heutigen Zeit zu entwickeln und zu funktionieren. Tag Erde.

MmS2 wuchs sowohl unter N2-fixierenden als auch unter nicht N2-fixierenden (NH3-veränderten) Wachstumsbedingungen, wenn synthetisches nanopartikuläres FeS2 oder Fe(II)/HS- als einzige Fe/S-Quellen und mit Formiat als Elektronendonor und Methanogenese bereitgestellt wurden Substrat (Abb. 1a–d). In Kulturen, die nicht mit einer Fe/S-Quelle versorgt wurden, kam es zu keinem Wachstum, unabhängig davon, ob die Zellen mit N2 oder NH3 versorgt wurden. Ebenso wuchsen Kulturen, die in Abwesenheit von NH3 und unter einem Gasraum aus Argon (Ar) gezüchtet wurden, unabhängig von der bereitgestellten Fe/S-Quelle nicht (Abb. 1a, c). Wichtig ist, dass MmS2 auch unter N2-Fixierungsbedingungen mit FeS2 in der Probe (63–150 µm Korngröße) wachsen konnte, was darauf hindeutet, dass eine natürliche (nicht im Labor synthetisierte) Form von FeS2 Fe und S während der N2-Fixierung bereitstellt (Abb. 1a, B). Zellzahlen und CH4-Messungen wurden in Kulturen mit FeS2-Proben selten durchgeführt, da vorläufige Experimente zeigten, dass sie empfindlich auf mechanische Störungen reagierten. Dies hängt möglicherweise mit den unterschiedlichen Geometrien des synthetischen nanopartikulären FeS2 zusammen, das aus kleinen Framboiden mit großer Oberfläche besteht, im Vergleich zu den großen und flachen Fazies der meist kubischen Probe FeS2, was die Fähigkeit der Zellen zur Anheftung beeinträchtigen könnte (ergänzende Abbildung). 1). Dennoch deuten diese Daten darauf hin, dass sowohl synthetische als auch natürliche Formen von FeS2 als einzige Fe/S-Quelle in N2-fixierenden MmS2-Zellen dienen können.

Wachstum und Aktivität wurden durch Quantifizierung der Zelldichte (a, b) bzw. der Methanproduktion (c, d) im Zeitverlauf überwacht. Die Felder a und b sowie c und d werden jeweils mit denselben y-Achsen dargestellt. Bei den dargestellten Daten handelt es sich um den Mittelwert und die Standardabweichung von drei biologischen Replikaten pro Bedingung. Ammoniak NH3, Argon Ar, Distickstoff N2, Eiseneisen Fe(II), Methan CH4, Pyrit FeS2, Sulfid HS-.

Die Gesamtzahl der in den NH3-modifizierten Kulturen produzierten Zellen war im Vergleich zu N2-fixierenden Kulturen höher, unabhängig von der bereitgestellten Fe/S-Quelle (Abb. 1a, b). Trotz Unterschieden in der endgültigen Zelldichte produzierten Kulturen, die unter allen Bedingungen (mit Ausnahme der Negativkontrollen) gezüchtet wurden, nach 54-stündiger Inkubation ähnliche Mengen an CH4 (Abb. 1c, d). Daher war die Zellausbeute (Zellen pro mmol CH4) in N2-Fixierungskulturen signifikant (p <0,01) niedriger als in NH3-modifizierten Kulturen (ergänzende Abbildung 2). Dieser Befund steht im Einklang mit einer fast dreifachen Verringerung der Zellausbeute des Methanogens Methanothermobacter thermolithotrophicus, wenn er unter N2-fixierenden Bedingungen im Vergleich zu NH3-veränderten Bedingungen gezüchtet wird48. Die für MmS2-Kulturen bereitgestellte Fe- und S-Quelle hatte auch einen deutlichen Einfluss auf die Zellproduktionsrate (Ergänzungstabelle 1) und die Gesamtzahl der unter N2-Fixierungsbedingungen produzierten Zellen, hatte jedoch nur minimale Auswirkungen auf NH3-veränderte Kulturen (Abb. 1a, b). Insbesondere hatten mit FeS2 versehene N2-fixierende Kulturen eine fast dreifach höhere (p <0,01) Zellausbeute als solche mit Fe(II)/HS- (ergänzende Abbildung 2). Im Gegensatz zu früheren Berichten, die zeigten, dass mit NH3 veränderte Kulturen von M. voltae und M. barkeri (beide Stämme MS und Fusaro) ähnliche Zellausbeuten erzielten, wenn sie mit FeS2 oder Fe(II)/HS-40,41 versehen wurden, wurde mit FeS2 gezüchtetes MmS2 hergestellt hatten eine um 29 % geringere Ausbeute als Fe(II)/HS-gezüchtete Zellen, die mit NH3 versorgt waren. Die Verringerung der Zellausbeute war jedoch noch dramatischer, wenn N2-fixierende MmS2-Zellen verglichen wurden, wobei die mit Fe(II)/HS- ausgestatteten Zellen eine 92-prozentige Verringerung der Ausbeute im Vergleich zu denen mit NH3 aufwiesen. Dies zeigt die energetische Belastung, die die N2-Fixierung den MmS2-Zellen auferlegt, und die Abhängigkeit dieser von der bereitgestellten Fe/S-Quelle.

Um die Unterschiede in der Wachstumskinetik und den Erträgen besser zu verstehen, die in Kulturen von MmS2 beobachtet wurden, die unter N2-fixierenden oder NH3-veränderten Bedingungen mit FeS2 oder Fe(II)/HS- als einziger Fe/S-Quelle gezüchtet wurden, wurde die Größe der Zellen während der Protokollierung ermittelt Die Phase in jeder Wachstumsbedingung wurde mithilfe der Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (FEM) bestimmt. Es wurde festgestellt, dass die durchschnittliche Größe von MmS2-Zellen für jede Wachstumsbedingung signifikant unterschiedlich war (p < 0,05), wobei mit Fe(II)/HS- gezüchtete NH3-modifizierte Zellen am größten waren, gefolgt von mit Fe(II) gezüchteten N2-fixierenden Zellen )/HS-. Die mit FeS2 gezüchteten NH3-veränderten Zellen waren noch kleiner und mit FeS2 gezüchtete N2-fixierende Zellen waren die kleinsten aller Behandlungen (Ergänzungstabelle 1).

Es wird vermutet, dass die Zellgröße positiv mit der Zellwachstumsrate (Zellteilung pro Stunde) und/oder der Nährstoffverfügbarkeit korreliert, obwohl die Regulierungsmechanismen für die Zellgröße in allen Lebensbereichen nur unzureichend verstanden sind49,50. Das „Wachstumsgesetz“ legt nahe, dass die Zellgröße positiv mit der Wachstumsrate korreliert50; Dies erklärt jedoch nicht die hier beobachteten Muster. Auf Fe(II)/HS- gezüchtete diazotrophe MmS2-Zellen hatten die zweitgrößte Größe, aber die niedrigsten der beobachteten Wachstumsraten unter allen vier Bedingungen (Ergänzungstabelle 1). Diese Ergebnisse deuten vielmehr darauf hin, dass das Wachstum auf FeS2 zu einer stärkeren Verringerung der Zellgröße führt als die N2-Fixierung und dass diese Effekte halbadditiv sind. Dies steht im Einklang mit neueren Daten, die darauf hindeuten, dass die Zellgröße eher eine Funktion der Nährstoffverfügbarkeit als nur der Wachstumsrate ist49, wobei nährstofflimitierte Bedingungen zu kleineren Zellgrößen führen, möglicherweise aufgrund des physiologischen Vorteils eines größeren Verhältnisses von Oberfläche zu Volumen für den Nährstofftransport über die Membran. Beispielsweise wurde gezeigt, dass das diazotrophe marine Cyanobakterium Crocosphaera watsonii als Reaktion auf die Fe-Limitierung eine etwa 2,2-fache Verringerung des Zellvolumens erfährt51. In ähnlicher Weise zeigten M. voltae-Zellen eine etwa 3,2-fache Verringerung des Zellvolumens, wenn sie auf FeS2 im Vergleich zu Fe(II)/HS-39 gezüchtet wurden. Die proteomische Analyse von M. voltae-Zellen ergab eine erhöhte Expression von Eisenaufnahmeproteinen (Feo), wenn sie mit FeS2 gezüchtet wurden, was darauf hindeutet, dass Zellen aufgrund der Assimilation von mit Sulfid komplexiertem Fe(II) (FeS(aq)) möglicherweise fälschlicherweise die Fe(II)-Limitierung wahrnehmen. ), obwohl in FeS2 gezüchtete Zellen einen höheren Fe-Gehalt aufweisen39. Im Vergleich dazu hat sich auch gezeigt, dass die N-Limitierung zu einer Verringerung der Zellgröße führt, mit einer etwa 1,5- bis 2,5-fachen Verringerung des Zellvolumens in heterotrophen Bakterioplankton-Isolaten, die unter N-limitierenden Bedingungen gezüchtet wurden52,53. Der semiadditive Effekt von Fe-, S- und N-Quellen und deren Verfügbarkeit auf die Größe und Wachstumsrate von MmS2-Zellen legt nahe, dass MmS2-Zellen auf tatsächliche oder wahrgenommene Einschränkungen eines oder mehrerer dieser Elemente reagieren.

Es wurde gezeigt, dass die Isotopenzusammensetzung von C in Biomasse und CH4 je nach Wachstumsrate, Substratverfügbarkeit und Umweltbedingungen in einer Vielzahl von Methanogenkulturen variiert54,55,56,57,58. Um die Auswirkung der N-Verfügbarkeit und der Fe- und S-Quelle auf den Phänotyp von MmS2 weiter zu bewerten und die N2-Fixierungsaktivität zu bestätigen, wurden stabile Isotope von C (δ13C) und N (δ15N) in CH4 und/oder Biomasse in unter gewachsenen Kulturen untersucht N2-fixierende oder NH3-veränderte Bedingungen mit entweder FeS2 oder Fe(II)/HS- als einziger Fe/S-Quelle.

MmS2-Zellbiomasse wies deutlich unterschiedliche δ15N-Werte auf, wenn sie unter N2-Fixierungs- oder NH3-modifizierten Bedingungen gezüchtet wurde (Abb. 2a). Unter N2-Fixierungsbedingungen gezüchtete Zellen hatten ähnliche δ15N-Werte von −3,22 ± 0,14 und −3,16 ± 0,06‰, wenn sie mit Fe(II)/HS- bzw. FeS2 versorgt wurden. Diese geringfügigen Unterschiede in den δ15N-Werten sind statistisch nicht signifikant (p = 0,55) und ähneln den δ15N-Werten von –4‰, die zuvor für N2-fixierende Methanocaldococcus- und Methanothermococcus-Stämme berichtet wurden, die aus hydrothermalen Quellen isoliert wurden59. Mit Fe(II)/HS- und FeS2 gezüchtete NH3-modifizierte MmS2-Zellen hatten nahezu identische δ15N-Werte von −21,63 ± 0,23 bzw. −21,61 ± 0,47‰. Es ist bekannt, dass die Assimilation von NH3 durch Mikroorganismen wie E. coli unter NH3-reichen Bedingungen Biomasse mit δ15N-Werten im Bereich von –16 bis –21‰ erzeugt60. Das zur Kultivierung von MmS2 verwendete NH4Cl-Salz hatte einen δ15N-Wert von -3,06‰ (Abb. 2a); Daher würde die Fraktionierung von δ15N in der Biomasse näher bei ~ −18,6‰ liegen und liegt daher im Bereich der erwarteten Werte für Zellen, die NH3 assimilieren.

Zellen (Biomasse) in der mittleren logarithmischen Phase wurden auf ihre Kohlenstoff-zu-Stickstoff-Massenverhältnisse (C/N) und δ15N-Werte analysiert (a). Biomasse und Methan wurden auch auf δ13C-Werte analysiert (b). Die Legende in a ist die gleiche wie in b. Bei den dargestellten Daten handelt es sich um den Mittelwert und die Standardabweichung von drei Replikatkulturen für alle Bedingungen. Isotopenergebnisse werden in der Delta-Notation als Promillewerte (‰) gegenüber Luft (δ15N) oder VPDB (δ13C) dargestellt. Weitere Daten finden Sie in den Zusatzdaten 1. Ammoniak NH3, Distickstoff N2, Eisen Eisen Fe(II), Methan CH4, Pyrit FeS2, Sulfid HS- .

Die δ13C-Werte für MmS2-Biomasse waren für alle getesteten Wachstumsbedingungen ähnlich (–48 bis –50‰), mit Ausnahme der Biomasse, die unter N2-Fixierungsbedingungen mit Fe(II)/HS- gezüchtet wurde (–46‰; Abb. 2b). . Frühere Studien haben eine verringerte Fraktionierung von C-Isotopen der Biomasse in Methanogenen als Hinweis auf einen geringeren Umsatz von C-Substraten interpretiert54, und dies steht im Einklang mit der langsamen Wachstumsrate und den niedrigen Zelldichten, die im N2-Fixierungszustand mit Fe(II)/HS- beobachtet werden. Dennoch liegen alle δ13C-Werte der Biomasse innerhalb des Wertebereichs der Biomasse (Bereich –30 bis –49‰), der zuvor für eine Vielzahl von Methanogenen beim Anbau mit verschiedenen Elektronendonoren/Kohlenstoffquellen unter verschiedenen Anbaubedingungen ermittelt wurde54. Die δ13C-Werte von CH4 waren insgesamt ähnlich (−58 bis −64‰), mit Ausnahme der mit Fe(II)/HS- ausgestatteten N2-fixierenden Zellen, die schwerer waren (−58‰), sich aber nicht signifikant unterschieden (p = 0,07). ) als die von N2-fixierenden Zellen, die mit FeS2 (−60‰) gezüchtet wurden (Abb. 2b). Wie die δ13C-Biomasse liegt auch der δ13C von CH4 innerhalb des Wertebereichs (–50 bis –100‰), der für Methanogenkulturen gemessen wird, wenn sie mit einer Vielzahl von Elektronendonoren/Methanogenesesubstraten unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen gezüchtet werden54,55,61. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass die N2-Fixierung den Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel von MmS2 beeinflusst, und dieser Effekt ist größer, wenn N2-fixierende Zellen mit Fe(II)/HS- versorgt werden, im Vergleich zu FeS2. Dies könnte auf die Konkurrenz um Molybdat zwischen Formiatdehydrogenasen, Nitrogenasen und möglicherweise Formylmethanofuran-Dehydrogenasen zurückzuführen sein, die durch HS-bedingte Abnahmen der Molybdänverfügbarkeit verstärkt werden kann (weiter unten näher erläutert). Es ist zu erwarten, dass dadurch die Geschwindigkeit der Formiatoxidation und der CO2-Produktion verringert wird, sodass der passive Austausch von intrazellulärem und extrazellulärem CO2 einen größeren Einfluss auf die Isotopenzusammensetzung von CH4 haben kann.

Zusätzlich zur Untersuchung der C- und N-Isotope wurden die Massen von C und N sowie das C/N-Verhältnis für Biomasseproben bestimmt (Abb. 2a). Die C/N-Verhältnisse waren unter allen Bedingungen ähnlich (Bereich von 3,4 bis 3,6), mit Ausnahme der auf Fe(II)/HS- gezüchteten N2-fixierenden MmS2-Zellen, die ein C/N-Verhältnis von 4,3 aufwiesen. Frühere Studien haben gezeigt, dass das C/N-Verhältnis in Kulturen heterotrophen marinen Bakterioplanktons um etwa 40 % ansteigt, wenn es auf festes N52 beschränkt ist. Darüber hinaus stieg das C/N-Verhältnis von N2-fixierenden Nostoc-Kulturen unter MoO42-Beschränkung um 80 %62. Das erhöhte C/N-Verhältnis von N2-fixierenden MmS2-Zellen, die mit Fe(II)/HS- versehen sind (Abb. 2a), deutet angesichts der geringen Zellausbeuten in diesem Zustand (ergänzende Abb. 2) auf N und hin /oder MoO42-Limitierung in diesen Zellen. Wichtig ist, dass Unterschiede in den autotrophen Pfaden, die von Methanogenen (Wood-Ljungdahl) und sauerstoffhaltigen Phototrophen (Calvin-Zyklus) genutzt werden, die Aufteilung von Kohlenstoff in Biomasse oder CH4 beeinflussen können und die hier verglichenen C/N-Verhältnisse in der Biomasse beeinflussen können.

Mithilfe der Shotgun-Transkriptomik wurden Genexpressionsprofile aus Log-Phase-Kulturen von N2-fixierenden und NH3-veränderten Zellen erstellt, die mit FeS2 oder Fe(II)/HS- als einziger Fe/S-Quelle versehen waren (Wachstumsdaten siehe Ergänzungstabelle 2). . Anschließend wurden Unterschiede in der Genexpression genutzt, um mit der Identifizierung der metabolischen/physiologischen Prozesse zu beginnen, die durch die bereitgestellten N-, Fe- und S-Quellen beeinflusst wurden. Insgesamt wurden 1737 einzigartige Transkripte unter den 1742 proteinkodierenden Genen, die von MmS2 kodiert wurden, nachgewiesen (99,7 % der Gene hatten nachweisbare Transkripte). Die Hauptkomponentenanalyse der Genexpressionsprofile ergab, dass sich die Proben je nach Kultivierungsbedingungen gruppierten (ergänzende Abbildung 3). Eine Vielzahl zellulärer Prozesse (215 Gene) wurde signifikant (p < 0,05) unterschiedlich reguliert zwischen N2-fixierenden und NH3-veränderten Zellen, die entweder mit Fe(II)/HS- oder FeS2 gezüchtet wurden (Abb. 3a). Die Mehrheit der Gene, die unterschiedlich zwischen N2-fixierenden und NH3-veränderten Zellen exprimiert wurden, hatten ähnliche log2-fache Änderungswerte für entweder Fe(II)/HS- oder FeS2-Bedingungen (d. h. diese Gene liegen auf einer 1:1-Linie in Abb . 3a), wobei weiter betont wird, dass die N2-Fixierung unabhängig von der Fe- und S-Quelle eine signifikante physiologische Reaktion hervorruft. Von diesen Genen waren diejenigen, die an der N2-Fixierung, dem Molybdän- und Eisentransport sowie der Metallbindung beteiligt sind, unter N2-Fixierungsbedingungen unabhängig von der Fe- und S-Quelle signifikant hochreguliert. Umgekehrt wurden ribosomale Gene, Gene, die an der zellulären Biosynthese (z. B. Acetyl-CoA-Synthase) und der Genomreplikation (z. B. DNA-Polymerase) beteiligt sind, unter N2-Fixierungsbedingungen unterdrückt. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit verringerten Wachstumsraten und Erträgen, die bei N2-fixierenden Zellen im Vergleich zu NH3-modifizierten Zellen beobachtet wurden, unabhängig von der bereitgestellten Fe- und S-Quelle (Abb. 1).

a Transkripte, die hinsichtlich der Stickstofffixierung im Vergleich zu mit Ammoniak veränderten Zellen signifikant unterschiedlich exprimiert wurden (p < 0,05, Wald-Test), wenn sie auf Eisen(II)-eisen und Sulfid (x-Achse) oder Pyrit (y-Achse) gezüchtet wurden, dargestellt als log2-fache Darstellung -Maßstab ändern. Positive Werte weisen auf eine höhere Expression unter Bedingungen der Stickstofffixierung hin, und negative Werte weisen auf eine höhere Expression unter Bedingungen mit verändertem Ammoniak hin. Um Vergleiche basierend auf der Eisen- und Schwefelquelle zu erleichtern, wird eine graue gestrichelte 1:1-Linie bereitgestellt. Die mittlere Transkriptexpression wird für ausgewählte Gene im Zusammenhang mit der Stickstofffixierung (b) und dem Molybdäntransport (c) gezeigt, die in der Reihenfolge organisiert sind, in der sie im Genom erscheinen. Jedes Gen wird durch einen farbcodierten Punkt (a) oder Pfeil (b, c) dargestellt, wobei die Locus-Tags in Klammern angegeben sind („MMP_RS“ wurde aus Platzgründen aus der Locus-Bezeichnung gekürzt). In der Legende rechts in jedem Feld sind die Gene entsprechend ihrer Funktion eingefärbt. Jeder Punkt stellt die mittlere normalisierte Expression von drei Kulturreplikaten pro Wachstumsbedingung dar. Statistisch signifikante (p < 0,05, Wald-Test) Unterschiede in der Expression für Stickstofffixierungs- und Ammoniak-verbesserte Bedingungen mit Eiseneisen und Sulfid (a) oder Pyrit (b) oder zwischen Stickstofffixierungsbedingungen, die entweder mit Eisen- oder Schwefelquellen angebaut wurden ( c) werden über jedem Gen für Panel b und c angezeigt. Eiseneisen Fe(II), Pyrit FeS2, Sulfid HS-, Distickstoff N2, Ammoniak NH3, keine Bedeutung, k.A

Kern-nif-Gene werden in einem einzelnen Operon in MmS263 kodiert, das transkriptionell durch das Repressorprotein NrpR und 2-Oxoglutarat reguliert wird, ein Signal der N-Limitierung64,65,66. Der nif-Transkriptionsregulator NrpR wurde basierend auf der N-Quelle nicht differenziell transkribiert, was mit früheren Berichten übereinstimmt, dass die Aktivität dieses Repressors unabhängig von seinen Konzentrationen in der Zelle ist (Abb. 3b)67. Gene, die die Kernstrukturkomponenten von Nif (nifHDK), Maturasen (nifENX) und regulatorischen Proteinen (nifI1, nifI2) kodieren, waren in N2-fixierenden MmS2-Zellen im Vergleich zu NH3-veränderten Zellen hochreguliert, und ihre Expressionsmuster waren unabhängig davon im Allgemeinen ähnlich Zellen wurden mit Fe(II)/HS- oder FeS2 versorgt (Abb. 3b). Ein einzelnes nif-Gen, nifB, liegt außerhalb des nif-Operons und wurde zwischen N2-Fixierungsbedingungen signifikant unterschiedlich exprimiert, wobei Fe(II)/HS-gezüchtete Zellen etwas geringere Expressionsniveaus aufwiesen als FeS2-gezüchtete Zellen. NifB ist für den Aufbau des FeMo-Cofaktor-Vorläufers NifB-co verantwortlich, der dann auf NifEN übertragen wird, wo die endgültige Reifung des Cofaktors durch die Zugabe von Mo und Homocitrat erfolgt68. Es ist nicht klar, warum die Expression von NifB unter N2-Fixierungsbedingungen in mit Fe(II)/HS gezüchteten Zellen geringer war. Zusätzlich zu den nif-Genen war die Expression von Glutaminsynthase (glnA) in N2-fixierenden Zellen im Vergleich zu NH3-modifizierten Zellen erhöht, dieser Unterschied war jedoch nur für mit FeS2 gezüchtete Zellen signifikant. GlnA ist ein wichtiges Enzym für die NH3-Assimilation in MmS264, und die höhere Expression in N2-fixierenden FeS2-gewachsenen Zellen könnte zu deren niedrigeren C/N-Verhältnissen beigetragen haben. Insgesamt zeigen die transkriptomischen Profile, dass MmS2 die Expression von Genen hochreguliert, die für Nif-Maturase-, Nif-Struktur- und NH3-Assimilationsproteine ​​(d. h. GlnA) kodieren, wenn N2 fixiert wird und die Expression dieser Gene bei den Fe/S-Quellen im Allgemeinen ähnlich ist.

Nif ist die einzige von MmS2 kodierte Nitrogenase und dieses Enzym ist Mo-abhängig42. Darüber hinaus kodiert MmS2 für eine Mo-abhängige Formiatdehydrogenase (Fdh)44,45 und sowohl Mo- als auch W-abhängige Formen der Formylmethanofuran-Dehydrogenase (Fmd bzw. Fwd), die für die Methanogenese mit Formiat46,47 erforderlich sind. Die Expression von fdh war unter den Bedingungen insgesamt ähnlich, wobei nur eine Untereinheit, die für ein Gen kodiert (fdhB; MMP_RS00800), unter NH3-veränderten Bedingungen im Vergleich zu N2-Fixierungsbedingungen bei Züchtung mit Fe(II)/HS- signifikant hochreguliert war (Ergänzungstabelle 3). ). Interessanterweise unterschied sich die Transkription von fwd und fmd zwischen den Wachstumsbedingungen, wobei drei von sieben fwd-Genen (MMP_RS06415-MMP_RS06425) unter NH3-veränderten Bedingungen im Vergleich zu N2-Fixierungsbedingungen in Fe(II)/HS-gewachsenen Zellen signifikant hochreguliert waren; Die Expression von fwd-Genen war unter NH3-veränderten Bedingungen im Vergleich zu N2-Fixierungsbedingungen in FeS2-gewachsenen Zellen ähnlich. Im Fall von fmd war die Expression eines gesamten Clusters von fünf fmd-Genen (MMP_RS02690-MMP_RS02710) in N2-fixierenden Zellen im Vergleich zu NH3-veränderten Bedingungen bei Züchtung mit FeS2 signifikant hochreguliert (log2-fache Änderung von ~1,5); Abgesehen von einem einzelnen fmdE-Gen (MMP_RS02690) unterschieden sich fmd-Transkripte in N2-fixierenden Zellen im Vergleich zu NH3-veränderten Zellen nicht signifikant, wenn sie mit Fe(II)/HS- gezüchtet wurden (Ergänzungstabelle 3). Es ist unklar, warum fwd unter NH3-veränderten Bedingungen mit Fe(II)/HS- hochexprimiert wurde, aber dies könnte an der sehr hohen Affinität von MoO42- für HS- und seiner geringen Löslichkeit liegen69. Dies wiederum würde die Bioverfügbarkeit von Wolframat (WO42-) im Vergleich zu MoO42- erhöhen, was in Kombination mit den höheren Wachstumsausbeuten unter den NH3-veränderten Bedingungen mit Fe(II)/HS- zu einer erhöhten Expression von fwd führt Transkripte. In ähnlicher Weise könnte die erhöhte Transkription von fmd-Genen unter N2-Fixierungsbedingungen im Vergleich zu NH3-veränderten Bedingungen auf FeS2 darauf hindeuten, dass Mo unter FeS2-Wachstumsbedingungen besser verfügbar ist, wobei die Expression von fwd-Transkripten nicht beeinträchtigt wird.

Mitglieder von Archaea und Bakterien erwerben Mo in Form von MoO42 – mithilfe von MoO42-spezifischen ABC-Transportern namens Mod70. Transkripte für drei von MmS2 kodierte Mod-bezogene Gencluster wurden in N2-fixierenden und NH3-veränderten Zellen verglichen, die mit FeS2 oder Fe(II)/HS- gezüchtet wurden (Abb. 3c). Die Expression von Genen, die alle drei Mod-Gencluster umfassen, war in N2-fixierenden Zellen im Vergleich zu NH3-modifizierten Zellen unabhängig von der Fe/S-Quelle hochreguliert. Darüber hinaus war die Expression von Genen, die zwei der drei Mod-Gencluster (MMP_RS01135-MMP_RS01145 und MMP_RS02670-MMP_RS02685) und einen annotierten NifC-ähnlichen Transporter (MMP_RS08475) umfassten, in N2-fixierenden Zellen, die mit Fe(II) gezüchtet wurden, signifikant hochreguliert (p < 0,05). )/HS- im Vergleich zu denen, die mit FeS2 gezüchtet wurden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die N2-Fixierung die Expression mutmaßlicher MoO42-Transporter erhöht, und diese Expression ist in N2-fixierenden Zellen, die mit Fe(II)/HS- gezüchtet wurden, höher als in solchen, die mit FeS2 gezüchtet wurden. Insgesamt legen diese Daten nahe, dass der MoO42-Transport nicht nur durch Anforderungen im Zusammenhang mit Mo-abhängigen Enzymen (Fdh, Fmd, Nif), sondern auch durch die Fe/S-Quelle beeinflusst wird. Genauer gesagt deuten die Ergebnisse auf eine Mo-Limitierung in N2-fixierenden Zellen hin, die mit Fe(II)/HS- gezüchtet wurden, möglicherweise aufgrund der HS-Komplexierung und/oder der Reaktion mit Mo38,71.

In einer früheren Studie wurde berichtet, dass HS- in einer Konzentration von >6 mM die N2-Fixierung in Flusssedimenten hemmt72. Während dieser Effekt auf die Toxizität von HS- in Zellen zurückgeführt wurde, die für die N2-Fixierung verantwortlich sind, ist es plausibel, dass das hinzugefügte HS- die Verfügbarkeit von Spurenmetallen (z. B. Fe, Mo) beeinflusste, die für die N2-Fixierung von Zellen erforderlich sind62,73,74, 75. Ein ähnlicher Effekt von HS- auf die Metallverfügbarkeit in N2-fixierenden MmS2-Kulturen könnte die geringeren Zellausbeuten und die erhöhte Expression von Mod-Genen erklären, die in Fe(II)/HS-gezüchteten Zellen im Vergleich zu denen, die mit FeS2 gezüchtet wurden, beobachtet wurden. MoO42- ist ein thiophiles Molekül, das leicht mit HS- reagiert, um lösliche Thiomolybdatspezies (MoO4-nSn2-) zu bilden, die letztendlich in Sulfidmineralien wie FeS271,76 eingebaut werden können. Es ist zu erwarten, dass solche Thiolierungsreaktionen unter den sulfidischen (2 mM) Kultivierungsbedingungen ablaufen, die typischerweise zur Kultivierung von Methanogenen77 verwendet werden und die hier für die mit Fe(II)/HS gezüchteten Kulturen verwendet wurden. Diese Euxin-Kultivierungsbedingungen schränkten möglicherweise die Verfügbarkeit von MoO42 ein, so dass es den zellulären Bedarf nicht deckte.

Um mit der Untersuchung dieser Hypothese zu beginnen, wurde die Speziation von Mo in abiotischen Reaktoren verfolgt, die ein anoxisches, basisches Salzmedium ohne Zusatz von NH3 oder Metallen enthielten. Die Reaktoren wurden mit verschiedenen Kombinationen von HS- (2 mM), Fe(II) (25 µM) oder FeS2 (2 mM) ergänzt, um die Kultivierungsbedingungen nachzuahmen, die in Experimenten bis zu diesem Zeitpunkt verwendet wurden. Dazu wurde Mo als MoO42- hinzugefügt und die Konzentration von MoO42- und seine Umwandlung in MoO4-nSn2- wurden über kolorimetrische Tests78 bzw. UV-Vis-Spektroskopie71 überwacht. Experimente wurden mit 10 µM MoO42- (im Gegensatz zu 4 µM, die hier zur Kultivierung von MmS2 verwendet wurden) durchgeführt, um die Signalempfindlichkeit so zu erhöhen, dass sie innerhalb des dynamischen Bereichs der verwendeten Tests lag.

Die MoO42-Konzentrationen blieben in Reaktoren, die nicht mit HS- angereichert waren, in Gegenwart oder Abwesenheit von FeS2 bei ~8–10 µM (ergänzende Abbildung 4a). Wie erwartet wurde das Produkt der vollständigen Thiolierung von MoO42-, Tetrathiomolybdat (MoS42-), unter diesen Bedingungen im Verlauf des Experiments nicht nachgewiesen (ergänzende Abbildung 4b). Im Gegensatz dazu nahmen die MoO42-Konzentrationen schnell ab (innerhalb der ersten 12 Stunden der Inkubation), wenn den Reaktoren HS- allein oder HS- und Fe(II) zugesetzt wurden (ergänzende Abbildung 4a). In Reaktoren, die HS- enthielten, wurde MoS42- schnell produziert (innerhalb der ersten Stunde der Inkubation) und MoO42- wurde nach 72-stündiger Inkubation vollständig in MoS42- umgewandelt. In Reaktoren, die sowohl HS- als auch Fe(II) enthielten, wurde die Umwandlung von MoO42- zu MoS42- beschleunigt und die vollständige Umwandlung erfolgte innerhalb der ersten 3 Stunden der Inkubation (ergänzende Abbildung 4b). UV-Vis-Spektroskopie ergab die Produktion von MoO4-nSn2-Zwischenprodukten in Reaktoren, die mit HS- mit oder ohne Fe(II) ergänzt wurden (ergänzende Abbildung 5). Ionen von MoO42-/Thiomolybdat haben eine starke Affinität zu Fe, einschließlich Fe in Eisensulfiden79,80, und es wurde gezeigt, dass diese Ionen in schwefelreichen Umgebungen leicht reagieren und stabile kubanähnliche Fe-Mo-S-Strukturen bilden80. Es ist möglich, dass die Beschleunigung der MoO42-Thiolierung durch Fe(II) in den hier beschriebenen Experimenten in ähnlicher Weise auf die Bildung stabiler kubanähnlicher Fe-Mo-S-Cluster zurückzuführen ist. Unabhängig davon deuten diese Daten darauf hin, dass MoO42- in mit FeS2 gezüchteten Kulturen leicht verfügbar ist, während die vorherrschenden Mo-Formen in mit Fe(II)/HS- gezüchteten Kulturen eine Mischung aus MoS42- und MoO4-nSn2- sind. Dies könnte möglicherweise das schlechte Wachstum und die Hochexpression von Mod-Genen in N2-fixierenden Kulturen erklären, die mit Fe(II)/HS- im Vergleich zu FeS2 ausgestattet sind. Es ist nicht bekannt, ob N2-fixierende MmS2-Zellen unter Fe(II)/HS-Bedingungen submikromolare Mengen an MoO42- verwenden, die unter der Nachweisgrenze (~1 µM) des hier verwendeten kolorimetrischen Assays liegen, oder ob sie dies verwenden können MoO4-nSn2- (wenn auch in begrenztem Umfang, basierend auf Wachstumsdaten), um ihren Mo-Nährstoffbedarf zu decken.

Um die Hypothese weiter zu testen, dass euxinische Bedingungen (d. h. überschüssiges HS-) die Verfügbarkeit von MoO42- in MmS2-Kulturen einschränken, wurde das Wachstum von mit Fe(II)/HS- ausgestatteten N2-fixierenden Zellen mit dem von mit Fe(II)/HS- ausgestatteten N2-fixierenden Zellen verglichen FeS2 in Gegenwart oder Abwesenheit von 2 mM zugesetztem HS-. Eine NH3-modifizierte MmS2-Kultur, die mit FeS2 und 2 mM zugesetztem HS- versehen war, wurde ebenfalls getestet. Wie zuvor beobachtet, zeigte mit FeS2 gezüchtetes MmS2 ein schnelleres Wachstum und eine schnellere CH4-Produktionskinetik und erzeugte höhere Zellerträge als Kulturen, die mit Fe(II)/HS- bei Fixierung von N2 versorgt wurden (Abb. 4a, b). Im Vergleich dazu zeigten mit FeS2 gezüchtete Kulturen mit 2 mM zugesetztem HS- unabhängig von der N-Quelle deutlich langsamere Zell- und CH4-Produktionsraten, was zeigt, dass HS- das Wachstum von MmS2 in mit FeS2 versorgten Zellen verringert. Während sowohl N2-fixierende als auch NH3-modifizierte Kulturen unter den Bedingungen von FeS2 und 2 mM zugesetztem HS- schlecht wuchsen, wurden N2-fixierende Zellen stärker negativ beeinflusst.

Zwei mM HS- wurden stickstofffixierenden oder mit Ammoniak angereicherten Kulturen zugesetzt, die mit Pyrit als primärer Eisen- und Schwefelquelle versehen waren, um dessen Wirkung auf die Produktion von Zellen (a) und Methan (b) zu testen. Gezeigt wird der Einfluss unterschiedlicher Molybdatkonzentrationen auf die Wachstumsraten (c) und Erträge (d) von Zellen, die entweder mit Pyrit oder Eiseneisen und Sulfid als einzige Eisen- und Schwefelquelle unter Stickstofffixierungsbedingungen gezüchtet wurden. Die maximalen Wachstumsraten (berechnet aus gemessenen Zelldichten) wurden über einen Zeitraum von 5 Tagen für jedes Replikat bestimmt. Bei den dargestellten Daten handelt es sich um den Mittelwert und die Standardabweichung von drei biologischen Replikaten pro Bedingung. Ammoniak NH3, Distickstoff N2, Eiseneisen Fe(II), Methan CH4, Pyrit FeS2, Sulfid HS-.

Wenn HS- das Zellwachstum unter N2-Fixierungsbedingungen durch seine Wirkung auf MoO42- negativ beeinflusst, wäre zu erwarten, dass auf FeS2 gezüchtete Zellen relativ gesehen einen geringeren Bedarf an MoO42- in Lösung haben als mit Fe(II)/HS- gezüchtete Zellen Bei der FeS2-Reduktion werden geringe Mengen HS- in die Lösung freigesetzt. Frühere Experimente mit H2-gewachsenen, N2-fixierenden MmS2-Zellen, die mit Fe(II)/HS- ausgestattet waren, ergaben, dass >400 nM MoO42- für das Wachstum erforderlich waren, mit einem Optimum von 4000 nM42. Diese Werte sind viel höher als die von anderen N2-fixierenden Organismen geforderten Werte. Zum Beispiel aerobe, N2-fixierende Cyanobakterien wie Anabaena variabilis81 sowie anaerobe N2-fixierende Purpurschwefelbakterien (PSB), die an der Grenzfläche von oxischen/euxinischen Gewässern leben und als modernes Analogon der produktiven Kontinentalränder proterozoischer Ozeane dienen82 , kann durch weniger als 10 nM MoO42- unterstützt werden. Interessanterweise war die maximale N2-Fixierung für das PSB oberhalb der Chemokline maximal, wo HS- nahe Null lag82. Daher erscheint es unpassend, dass Methanogene 40-mal mehr MoO42 benötigen als diese Organismen, obwohl die Vorfahren von Methanogenen wahrscheinlich der Ursprungsort von Nif waren6,9.

Um dies weiter zu testen, wurden aus Formiat gezüchtete und N2-fixierende MmS2-Zellen mit einer Reihe von MoO42-Konzentrationen mit Fe(II)/HS- oder FeS2 als einziger Fe/S-Quelle versorgt. In Übereinstimmung mit früheren Arbeiten42 zeigte MmS2, das auf Fe(II)/HS- gezüchtet wurde, unter Bedingungen mit <100 nM MoO42- kaum bis gar keine Wachstumsreaktion, aber die Wachstumsraten stiegen erheblich, wenn ≥500 nM MoO42- bereitgestellt wurde (Abb. 4c). Die Zellausbeuten erreichten in Fe(II)/HS-gezüchteten Zellen erst dann ihr Maximum, wenn >1000 nM MoO42- bereitgestellt wurden (Abb. 4d). Bemerkenswerterweise wuchsen mit FeS2 versorgte Zellen unter allen getesteten Mo-Konzentrationen gut, auch wenn 0 µM MoO42- zugesetzt wurden (Abb. 4c). Nach diesem Experiment wurden abiotische Reaktoren, die Medien und FeS2 (kein MoO42-Zusatz) enthielten, mittels ICP-MS analysiert und es wurde festgestellt, dass sie trotz der Verwendung von ACS-Qualitätschemikalien und säuregewaschenen Glaswaren einen Mo-Hintergrund (Verunreinigungsstoff) im Bereich von 10 bis 30 nM aufwiesen. Somit benötigten Fe(II)/HS-gezüchtete N2-fixierende Zellen >500 nM MoO42-, um nahezu optimale Wachstumsraten und Erträge zu erzielen, wohingegen mit FeS2 gezüchtete N2-fixierende Zellen <30 nM MoO42- benötigten.

Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass mit FeS2 gezüchtete MmS2-Zellen (in Abwesenheit hoher Konzentrationen an freiem HS-) auf MoO42- bei nM-Konzentrationen zugreifen können, die > 10-fach niedriger sind als zuvor für diesen Stamm berichtet42. Darüber hinaus können MmS2-Zellen optimale Wachstumsraten und Erträge bei MoO42-Konzentrationen erzielen, die etwa 100-fach niedriger sind als bisher berichtet42. Trotz ähnlicher Wachstumsraten für die FeS2-Bedingungen bei verschiedenen MoO42-Konzentrationen gab es einen positiven Trend in der Zellausbeute mit steigendem MoO42-, was darauf hindeutet, dass höhere MoO42-Konzentrationen für diese Zellen immer noch vorteilhaft sind (Abb. 4d). Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit anderen Studien, die eine N2-Fixierung bei niedrigen Mo-Konzentrationen bei Zellen gezeigt haben, die unter nicht-sulfidischen Bedingungen gezüchtet wurden81,82. Bemerkenswert ist, dass die geringen Konzentrationen (10–30 nM) von MoO42-, von denen gezeigt wurde, dass sie die N2-Fixierung unterstützen, den abgeleiteten Mo-Konzentrationen proterozoischer Ozeane ähneln83,84,85). Andere Studien, die den Mo-Bedarf für andere Methanogenspezies, die N2 fixieren, untersuchten, ergaben, dass 1 bis 10 µM MoO42- die optimale Konzentration sind86,87. Es gibt ein weiteres Beispiel dafür, dass Methanogene N2 bei niedrigen (<10 nM) MoO42-Konzentrationen binden; Nishizawa et al. zeigten, dass Isolate von Methanocaldococcus und Methanothermococcus aus einer hydrothermalen Quelle N2 mit nur 5 nM bzw. 1 µM MoO42- fixieren konnten59. Dies weist darauf hin, dass verschiedene Methanogenspezies innerhalb derselben hydrothermalen Umgebung (bei unterschiedlichen Temperaturen) sehr unterschiedliche Mo-Anforderungen haben können. Wichtig ist, dass diese früheren Experimente alle in Gegenwart von >1 mM HS- durchgeführt wurden, was eine Neubewertung der Fähigkeit von Methanogenen und anderen Anaerobiern zum Zugriff auf MoO42- in Abwesenheit von hohem HS- erforderte. Diese Daten stützen die Hypothese, dass die N2-Fixierung über Nif unter Bedingungen mit niedrigem HS-Gehalt, in denen Mo besser bioverfügbar ist, effizienter ist.

Überschüssiges HS unterdrückte das Wachstum von MmS2 beim Wachstum mit FeS2 (euxinische Bedingungen), unabhängig von der bereitgestellten N-Quelle (Abb. 4). Als nächstes wurde das Wachstum N2-fixierender Zellen in FeS2-Kulturen mit Mediumformulierungen verglichen, die so konzipiert waren, dass sie milde (100 µM zugesetztes Fe(II)) und stark (1000 µM zugesetztes Fe(II)) eisenhaltige Bedingungen nachahmen und leicht nachahmen ( 100 µM zugesetztes HS-) und stark (1000 µM zugesetztes HS-) euxinische Bedingungen. Kontrollkulturen enthielten FeS2 als einzige Quelle für Fe und S. Zelldichten und CH4-Konzentrationen wurden als Wachstumsindikatoren überwacht und HS- wurde als Proxy für die FeS2-Reduktion gemessen.

MmS2-Zellen wuchsen unter leicht eisenhaltigen Bedingungen besser als unter leicht und stark euxinhaltigen Bedingungen, obwohl der stark eisenhaltige Zustand eine längere Verzögerungsphase verursachte (Abb. 5a). Das Wachstum von MmS2-Zellen unter euxinischen Bedingungen, insbesondere mit 1000 µM zugesetztem HS-, war im Vergleich zu Zellen, die mit FeS2 als Kontrolle gezüchtet wurden, stark verringert. Trotz der Unterschiede in der Gesamtdichte der Zellen am Ende des Experiments produzierten alle Bedingungen ähnliche Mengen an CH4 (Abb. 5b). Dies führte zu deutlichen Unterschieden in den endgültigen Zellerträgen (Abb. 5d) sowie in den Erträgen während der Protokollierungsphase (ergänzende Abb. 6). Insbesondere waren die Zellerträge im leicht eisenhaltigen Zustand sogar im Vergleich zum Kontrollzustand (nur FeS2) am höchsten. Auch hier waren die Ausbeuten von Zellen, die unter euxinischen Bedingungen gezüchtet wurden, deutlich geringer als die von Zellen, die entweder unter eisenhaltigen Bedingungen oder unter den Kontrollbedingungen (nur FeS2) gezüchtet wurden. Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass für N2-fixierende MmS2-Zellen leicht eisenhaltige Bedingungen bevorzugt werden.

Die Produktion von Zellen (a), Methan, CH4 (b) und HS- (c) wurde in Kulturen von MmS2 überwacht, die mit 2 mM Pyrit (FeS2) als einziger Fe/S-Quelle, mit FeS2 und 100 oder 1000 µM versehen waren Fe(II) oder mit FeS2 und 100 oder 1000 µM HS-. Die Zellausbeuten (d) in jeder Wachstumsbedingung wurden unter Verwendung der anfänglichen und maximalen Zell- und CH4-Konzentrationen für jedes Replikat berechnet. Die Legende am unteren Rand der Abbildung gilt für alle vier Panels. Statistisch signifikante (p < 0,05, t-Test) Unterschiede wurden in Panel d paarweise bestimmt und sind über jedem Balken dargestellt, wobei die Symbole aus der Legende verwendet werden, um die signifikant unterschiedlichen Paare zu kennzeichnen. Bei den dargestellten Daten handelt es sich um den Mittelwert und die Standardabweichung von drei biologischen Replikaten pro Bedingung. Eiseneisen Fe(II), Methan CH4, Pyrit FeS2, Sulfid HS-.

Der Gesamtsulfidgehalt (HS-, H2S und säurelabiles Eisensulfid) wurde in ungefilterten Kulturproben als Indikator für die FeS2-Reduktion gemessen41. Trotz aller Bedingungen, die die Mobilisierung von FeS2 erfordern, um entweder auf Fe (euxinische Bedingungen), S (eisenhaltige Bedingungen) oder sowohl Fe als auch S (Kontrollbedingung) zuzugreifen, unterschied sich die Produktion von Gesamtsulfid zwischen den Bedingungen (Abb. 5c). Für FeS2 allein (Kontrollbedingungen) wurden am Ende des Experiments 34 µmol Gesamtsulfid beobachtet, während unter leicht euxinischen Bedingungen 46 µmol Gesamtsulfid erzeugt wurden. Unter Berücksichtigung des zugesetzten HS- (100 µM, 7,5 µmol) wurden 38 µmol Gesamtsulfid produziert, abzüglich dessen, was von den Zellen unter leicht euxinischen Bedingungen assimiliert wurde. Darüber hinaus deutet dies darauf hin, dass unter diesen beiden Wachstumsbedingungen ein ähnlicher Grad an zellulärer FeS2-Reduktion stattgefunden hat; Allerdings wurde im leicht euxinischen Zustand aufgrund der geringen Zellproduktion mehr FeS2 pro Zelle reduziert. In ähnlicher Weise wurden im stark euxinischen Zustand (1000 µM, 75 µmol hinzugefügtes HS-) am Ende des Experiments 148 µmol Gesamtsulfid gemessen, was darauf hindeutet, dass pro Zelle mehr FeS2 reduziert wurde als unter Kontrollbedingungen, die eine geringe Zellproduktion berücksichtigen der ehemalige Zustand (Abb. 5a). Die gesamte Sulfidproduktion in Kulturen, die unter eisenhaltigen Bedingungen gezüchtet wurden, war weitaus geringer als in Kontrollkulturen (nur FeS2). Insbesondere erzeugten milde (100 µM zugesetztes Fe(II)) eisenhaltige Bedingungen nur 4 µmol Gesamtsulfid, während das gesamte Sulfid unter stark (1000 µM zugesetzten Fe(II)) eisenhaltigen Bedingungen bis zum letzten Zeitpunkt, an dem 0,3 µmol nachgewiesen wurden, nicht nachweisbar blieb. Daher ist die Menge an FeS2, die reduktiv aufgelöst werden muss, um den biosynthetischen Bedarf an Fe oder S zu decken, unter eisenhaltigen Bedingungen geringer als unter euxinischen Bedingungen, was auch zur Erklärung eines besseren Wachstums unter diesen Bedingungen beitragen kann.

Die Auswirkungen, die HS- auf mit FeS2 gezüchtete Zellen hatte, sind wahrscheinlich auf die komplexen Bedingungen zurückzuführen, die entstehen, wenn HS-, FeS2 und Spurenmetalle (d. h. Mo, Fe(II)) gleichzeitig auftreten. Hohe HS--Konzentrationen verringern die thermodynamische Begünstigung der FeS2-Reduktion41, was die FeS2-Reduktion zum geschwindigkeitsbestimmenden Prozess in diesen Kulturen machen und möglicherweise die langsamere Produktion von CH4 erklären könnte, die in mit FeS2 gezüchteten Kulturen mit zugesetztem HS- beobachtet wird (Abb. 4b und 5b). . Darüber hinaus kann ein hoher HS-Wert die Metallverfügbarkeit nicht nur von MoO42-, sondern auch von Fe(II) verringern, das bei der FeS2-Reduktion freigesetzt wird. Spietz et al. beschreiben ein Modell für die reduktive Auflösung von FeS2 durch Methanogene, wobei durch die FeS2-Reduktion HS- in Lösung freigesetzt wird und Pyrrhotit (Fe1-xS) als Sekundärphase auf der Mineraloberfläche ausgefällt wird41. Die Auflösung von Fe1-xS führt zur Freisetzung von Fe(II) (jedoch nicht von HS-), das dann mit löslichem HS- reagieren kann, um FeS(aq)-Cluster zu bilden, die vermutliche Quelle von Fe/S für diese Zellen39,41. In abiotischen Experimenten mit in 100-kDa-Dialysemembranen sequestriertem Fe1-xS wurde gezeigt, dass die Auflösung und/oder Diffusion von Fe aus Fe1-xS in das Hauptmedium in Gegenwart von 500 µM HS- im Vergleich zu keinem zugesetztem HS signifikant verringert war -41. Dies könnte darauf hindeuten, dass HS- die Geschwindigkeit der FeS(aq)-Keimbildung und Wiederausfällung als Mackinawit-Nanopartikel (FeSmack) erhöht, die zu groß sind, um durch die Zellmembran zu diffundieren. Es ist zu erwarten, dass solche Partikel die Verfügbarkeit von Fe (und S) für Zellen einschränken41. Man geht davon aus, dass diese Effekte von HS- unter eisenhaltigen Bedingungen nicht auftreten, weil Fe(II) HS- effektiv reinigt oder weil Zellen die FeS2-Reduktion minimieren, so dass das gesamte aus dem Prozess freigesetzte HS- assimiliert wird. Es ist auch wichtig, die Tendenz zu berücksichtigen, dass Spurenmetalle auf FeS2-Oberflächen adsorbiert werden, was wiederum ihre Konzentration in Lösung verringert. Dies ist bei MoS42- der Fall, dem Produkt der vollständigen MoO42-Thiolierung (siehe oben), das stärker an FeS2-Oberflächen adsorbiert als MoO42-80.

Die hier durchgeführten Experimente zielten darauf ab, die plausibelsten Bedingungen (euxinisch oder eisenhaltig) zu identifizieren, die die N2-Fixierung über Nif im frühen Proterozoikum ermöglicht hätten, als phylogenetische Daten darauf hindeuten, dass sich dieses Enzym entwickelte6,7,8, oder sogar im späten Archaikum, als es isotopisch war Daten deuten darauf hin, dass sich dieses Enzym oder sein Vorgänger weiterentwickelt hat21,22. Es wurden Experimente mit dem marinen Methanogen MmS2 durchgeführt, das ein Nif-Homolog enthält, das zur am tiefsten verzweigten Nif-Linie gehört6,8,9. Die Daten zeigten, dass euxinische Bedingungen (Überschuss an HS- im Verhältnis zu freiem Fe(II)) das Wachstum von N2-fixierenden MmS2-Zellen negativ beeinflussten, unabhängig davon, ob sie mit Fe(II)/HS- oder FeS2 gezüchtet wurden. Es wurde gezeigt, dass dies auf die Wirkung von HS- auf die Speziation und Verfügbarkeit von Mo zurückzuführen ist. Unter eisenhaltigen Bedingungen titriert jedoch überschüssiges Fe(II) HS-, was zu dessen Ausfällung als FeSmack und FeS2 führt, was wiederum die Bildung von Mo ermöglicht bleiben als MoO42- bioverfügbar. Tatsächlich waren die Wachstumsrate und der Ertrag von N2-fixierenden MmS2-Zellen deutlich höher, wenn die Zellen mit FeS2 und überschüssigem Fe(II) (eisenhaltige Bedingungen) gezüchtet wurden, als wenn sie mit i) FeS2 und überschüssigem HS- (euxinische Bedingungen) gezüchtet wurden, ii) FeS2 allein oder iii) unter kanonischen Bedingungen, die typischerweise zur Kultivierung von Methanogenen, überschüssigem HS- und Fe(II) verwendet werden (ebenfalls eine euxinische Bedingung).

Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass MmS2 während des Wachstums mit Formiat als Methanogenesesubstrat und mit N2 als einziger N-Quelle FeS2 gegenüber Fe(II)/HS- bevorzugt, Bedingungen, die den Bedarf an Mo über Fdh, Nif und Fmd erhöhen. Darüber hinaus wuchsen Zellen mit FeS2 effizienter, wenn die Konzentration von MoO42- etwa 100-fach niedriger war als mit Fe(II)/HS- gezüchtete Zellen. Diese Daten legen nahe, dass eine eisenhaltige Umgebung die Funktion und möglicherweise den Ursprung von Nif auf der frühen Erde begünstigt hätte. Im Gegensatz dazu stellen euxinische Bedingungen erhebliche Herausforderungen beim Zugang zu thiophilen Metallen dar, die für die N2-Fixierung von Zellen sowohl in alten als auch in modernen Umgebungen erforderlich sind, wodurch die N2-Fixierung über Nif eingeschränkt wird. Da die Metallverfügbarkeit ein wesentlicher Faktor für die Entwicklung von Metalloenzymen ist (Übersicht in83), vermuten wir, dass sich Nif wahrscheinlich in einer Umgebung entwickelt hat, die die Verfügbarkeit von Fe und Mo begünstigt.

Synthetisches FeS2 wurde in einer anaeroben Kammer synthetisiert, indem separate Lösungen von 16,7 g FeSO4 · 7 H2O und 17,28 g Na2S · 9 H2O, jeweils gelöst in 50 ml anoxischem, entionisiertem MilliQ H2O (MQ), in einer 500-ml-Medienflasche gemischt wurden. Dann wurden 2,1 g elementarer Schwefel in den Reaktor gegeben, der dann mit einem Gummistopfen verschlossen und aus der anaeroben Kammer entfernt wurde. Der Reaktor wurde dann vier Tage lang bei 65 °C inkubiert, gefolgt von weiteren vier Tagen bei 85 °C. Der Reaktor wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt und in einem chemischen Abzug geöffnet, wo das resultierende Mineral in Zentrifugenröhrchen gesammelt und mehrmals aerob mit MQ, 1 M HCl, 6 M HCl und Aceton gewaschen wurde. Abschließend wurde das Mineral mehrmals in einer anaeroben Kammer in sterilem, anoxischem MQ gewaschen und als Aufschlämmung in eine sterile Glasserumflasche überführt40. Die getrocknete FeS2-Probe wurde zerkleinert und gesiebt (Partikelgröße 63–150 µm), bevor sie der gleichen Waschreihe wie das synthetische FeS2 unterzogen wurde. Die FeS2-Probe wurde dann unter einem N2-Strom getrocknet und in einer sterilen Glasserumflasche aufbewahrt, bis sie in einer anaeroben Kammer gewogen und dann direkt in Kulturflaschen gegeben wurde. Synthetisches FeS2 wurde als Aufschlämmung in vorbereitete Kulturflaschen gegeben. Mineralien wurden vor ihrer Verwendung in Experimenten durch Röntgenbeugung charakterisiert (ergänzende Abbildung 7).

Der M. maripaludis-Stamm S2 (MmS2), freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Kyle Costa, wurde in Fe- und S-freiem Basismedium gezüchtet, das (g L−1) enthielt: NaCl, 21,98; MgCl2 · 6H2O, 5,10; NaHCO3, 5,00; K2HPO4, 0,14; KCl, 0,33; CaCl2 · 2H2O, 0,10. Für NH3-modifizierte Kulturen wurde NH4Cl bis zu einer Endkonzentration von 0,50 g L−1 zugesetzt. Das Basismedium wurde mit 25 µM FeCl2 · 4H2O und 2 mM Na2S · 9H2O für mit Fe(II)/HS gezüchtete Zellen ergänzt. Experimente zur Sulfidzugabe testeten die Wirkung von 2 mM HS- während des Wachstums auf FeS2. Eisen und HS- wurden aus anoxischen, autoklavierten Stammlösungen 30 Minuten lang zugegeben. vor der Impfung. Für FeS2-Wachstumsbedingungen wurde das Basismedium mit synthetischem FeS2 auf eine Endkonzentration von 2 mM Fe (0,018 g pro 75 ml Medium) oder mit 1,5 g Proben-FeS2 ergänzt. Die höhere Menge an FeS2 der Probe wurde hinzugefügt, um Unterschiede in der geschätzten Oberfläche der Probe im Vergleich zu synthetischem FeS240 zu berücksichtigen. Das Basalmedium wurde mit Spurenelement-, Vitamin-, Formiat- und Acetatlösungen (Ergänzungstabelle 4) ergänzt (jeweils 1 % v/v Endkonzentration). Die Vitaminlösungen wurden filtersterilisiert (0,22 µm), während die Spurenelement-, Formiat- und Acetatlösungen einzeln durch Autoklavieren sterilisiert wurden. Alle Lösungen wurden mit gefiltertem (0,22 µm) N2 gespült. N2 und andere in dieser Studie verwendete Gase wurden über eine beheizte Säule (300 °C) geleitet, die H2-reduzierte Kupferspäne enthielt.

Zur Herstellung des Wachstumsmediums wurden alle Komponenten außer NaHCO3 in MQ H2O gelöst und dann weniger als 1 Minute lang gekocht. Nach dem Sieden wurde die Flasche mit dem Medium vom Herd genommen und mit einem Butylkautschukstopfen mit einer Metallkanüle und einer Entlüftungsnadel verschlossen und 1 Stunde lang mit N2-Gas pro Liter Medium gespült. Nach dem Entgasen wurde die Flasche verschlossen, in eine anaerobe Kammer gebracht und nach dem Abkühlen mit NaHCO3 versetzt. Nach Zugabe dieser Komponenten wurde der pH-Wert des Mediums mit anoxischer 2 M HCl oder 1 M NaOH auf 7,00 eingestellt. 75 Milliliter Medium wurden in 165-ml-Serumflaschen abgefüllt, die dann mit neuen und frisch gekochten 20-mm-Stopfen aus blauem Butylkautschuk (Bellco, Vineland, NJ) und Bördelkappen aus Aluminium verschlossen wurden. Der Kopfraum der Mediumflaschen wurde 20 Minuten lang mit 80:20 N2:CO2 gespült. Anschließend wurden die Flaschen 20 Minuten lang bei 123 °C autoklaviert. Nach dem Autoklavieren wurden FeS2, Fe(II), HS-, Spurenelemente, Vitamine und organische Stoffe in den oben angegebenen Konzentrationen zugegeben.

MmS2 wurde durch zweimal wöchentliche Transfers in einem definierten Medium mit Fe(II)/HS-, N2-Gas und Formiat aufrechterhalten. Die Kulturen wurden auf einer Basis von 5 % v/v mit Zellen geimpft, die unter N2-fixierenden Bedingungen gezüchtet wurden und mit Fe(II)/HS- versehen waren. Alle Zellen wurden in basalem, NH3-freiem Medium (ohne Zusätze) durch 20-minütiges Zentrifugieren bei 4696 x g und 20 °C in einem Ausschwingrotor für alle Experimente gewaschen. Die Dichte eines Aliquots der gewaschenen Zellen wurde dann unmittelbar vor ihrer Verwendung als Inokulum gezählt. Die Kulturen wurden mit entweder 80:20 N2:CO2 oder Ar:CO2 auf einen Druck von 2,87 atm gebracht. Alle Kulturen wurden statisch auf der Seite liegend bei 38 °C im Dunkeln inkubiert.

Headspace-Gas aus Mikrokosmen wurde mit einer N2-gespülten Spritze und einem Absperrhahn entnommen und vor der CH4-Bestimmung mit ultrahochreinem N2 in CaliBond-Beuteln (Calibrated Instruments Inc., Manhasset, NY) verdünnt. Flüssige Proben wurden auf dem Tisch mit einer N2-gespülten Spritze und Nadel entnommen. CH4 wurde durch Gaschromatographie quantifiziert und das Gesamtsulfid wurde kolorimetrisch über den Methylenblau-Assay quantifiziert, wie zuvor beschrieben40. Zellen für die direkte Zählung wurden zunächst vier Stunden lang in 2,5 % v/v (Endkonzentration) Glutaraldehyd bei 4 °C fixiert und dann unter Verwendung einer Petroff-Hausser-Zählkammer auf einem Nikon YS100-Lichtmikroskop mit einer 100-fachen Ölobjektivlinse (Nikon) gezählt , Tokyo, Japan). Fixierte Zellproben wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 15.000 x g konzentriert und im Basismedium mit ausreichendem Volumen resuspendiert, um die Zellzählung zu erleichtern

Um die Stabilität von MoO42- in verschiedenen hier verwendeten Medienformulierungen zu testen, wurden 75 ml NH3-freies Basissalzmedium, das Spurenelemente ohne MoO42-, Formiat, Acetat oder Vitamine enthielt, in 165-ml-Serumflaschen gegeben. Die Vorbereitung des Mediums erfolgte wie oben für MmS2-Kulturen beschrieben. Die Zusammensetzung im Kopfraum betrug 80:20 N2:CO2. Das Medium wurde mit Na2MoO4 · 4H2O (10 µM Endkonzentration), Na2S · 9H2O (2 mM), FeCl2 · 4H2O (25 µM) oder synthetischem FeS2 (2 mM) ergänzt. Die Reaktoren wurden bei 38 °C im Dunkeln inkubiert und in eine anaerobe Kammer (97,5 % N2, 2,5 % H2) überführt. Teilproben für die Spektroskopie wurden mit einer Spritze und einer Nadel gesammelt und in Einweg-Kunststoffküvetten (1 cm Schichtdicke) gegeben vor der Entnahme aus der anaeroben Kammer mit Küvettenkappen aus Kunststoff verschlossen werden. Die Konzentration von MoO42- wurde kolorimetrisch mit einem modifizierten Catechol-Assay78 bestimmt. Der Assay wurde modifiziert, um die Konzentrationen der Arbeitslösungskomponenten um das Vierfache zu erhöhen, und das Volumenverhältnis von Probe zu Arbeitslösung wurde auf 4:1 angepasst, mit einem Gesamtassayvolumen von 1 ml, das bei 400 nm mit einem Genesys 10 S gemessen wurde Vis-Spektrophotometer (Thermo Scientific, Waltham, MA). Die Arbeitslösung wurde vorbereitet und zwei Wochen vor dem Experiment in der anaeroben Kammer gelagert. Zur Tetrathiomolybdat-Quantifizierung wurde 1 ml der Probe direkt bei 467 nm gemessen. UV-Vis-Scans (300 nm bis 525 nm) wurden mit einem Cary UV-Vis-NIR 6000i-Spektrophotometer (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) unter Verwendung derselben Proben durchgeführt, die für die Tetrathiomolybdat-Quantifizierung vorbereitet wurden. Die Probenabsorptionswerte für jeden Test wurden mit einer Standardkurve verglichen, die mit frischen Reagenzien (Na2MoO4 · 4H2O oder MoS4(NH4)2) erstellt wurde.

Um die Größe der unter verschiedenen Bedingungen gezüchteten Zellen zu charakterisieren, wurde Feldemissionselektronenmikroskopie (FEM) durchgeführt. Fünf Milliliter Zellkultur wurden als Teilprobe aus Kulturen in der mittleren logarithmischen Phase entnommen, die in Transkriptomik-Experimenten verwendet wurden (siehe unten). Die Zellen wurden zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in 2,5 % EM-Glutaraldehyd (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) in Basalmedium fixiert. Die fixierten Zellen wurden dann mittels sanfter Vakuumfiltration auf einen zuvor mit Au gesputterten 0,2 µm schwarzen Isopore-Polycarbonatfilter (MilliporeSigma, Burlington, MA) filtriert. Anschließend wurden die Zellen durch Zugabe von 10 ml Basalmedium zum Filter gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Zellen einer Ethanol-Dehydratisierungsreihe (durch Filtration) unter Verwendung von Ethanol molekularer Qualität (25 %, 50 %, 70 %, 85 %, 95 %, 100 %) unterzogen und dann bis zur FEM bei 4 °C gelagert durchgeführt im Imaging and Chemical Analysis Laboratory der Montana State University. Die Proben wurden mit doppelseitigem Kohlenstoffband auf dem FEM-Halter befestigt und vor der Bildgebung mit einem dünnen Iridiumfilm zur Leitfähigkeit besputtert. Die FEM wurde unter Verwendung eines hochauflösenden Supra 55VP-Elektronenmikroskops (Zeiss, Thornwood, NY) mit einer Primärelektronenstrahlenergie von 1 keV bei verschiedenen Vergrößerungen durchgeführt. Die Zellgröße wurde mit ImageJ bestimmt, um einzelne Zellen manuell zu messen, indem die Länge von zwei normalen Messungen aufgezeichnet wurde, die auf die Bildmaßstabsleiste kalibriert waren.

Die Shotgun-Transkriptomik wurde an MmS2-Zellen durchgeführt, die unter N2-fixierenden oder NH3-veränderten Bedingungen mit entweder Fe(II)/HS- oder FeS2 als einziger Fe/S-Quelle gezüchtet wurden. Fünfzig Milliliter Kultur wurden während der Mid-Log-Phase in einer anaeroben Kammer durch 30-minütige Zentrifugation bei 4696 x g und 4 °C geerntet. Der Überstand wurde dann verworfen und die Röhrchen wurden aus der anaeroben Kammer entfernt und sofort in flüssigem N2 schockgefroren. Zellpellets wurden bis zur RNA-Extraktion bei –80 ° C gelagert.

Die Gesamt-RNA wurde aus Zellpellets mit TRIzol-Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA) extrahiert, wobei das Protokoll des Herstellers mit geringfügigen Änderungen befolgt wurde. Den Zellpellets wurde ein Milliliter TRIzol zugesetzt und die resuspendierten Zellen wurden auf Eis in Lysis-E-Röhrchen (MP Biomedicals, Irvine, CA) überführt. Die Zellproben wurden mechanisch durch drei Zyklen von 40 Sekunden langem Schlagen der Perlen und 5 Minuten Ruhe bei Raumtemperatur (~20 °C) lysiert. Nach dem Lysevorgang wurden 200 µl Chloroform in Molekularqualität zugegeben, die Röhrchen wurden durch Umdrehen gemischt und 3 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Röhrchen wurden dann 15 Minuten lang bei 12.000 x g und 4 °C zentrifugiert und die obere wässrige Phase, die RNA enthielt, wurde per Pipette in ein sauberes 2-ml-Röhrchen überführt. Die RNA wurde durch Zugabe von 0,5 ml 100 % molekularem Isopropanol, das auf 4 °C vorgekühlt war, und anschließende 10-minütige Inkubation auf Eis ausgefällt. Anschließend wurde die RNA durch 10-minütige Zentrifugation bei 12.000 x g und 4 °C pelletiert. Der Überstand wurde mit einer Pipette entfernt und die RNA wurde in 1 ml 75 % molekularem Ethanol gewaschen. Die RNA wurde durch 5-minütige Zentrifugation bei 7500 x g und 4 °C pelletiert, der Überstand wurde entfernt und das RNA-Pellet wurde 10 Minuten lang an der Luft getrocknet. Nach dem Trocknen wurde die RNA in 50 µL RNA-freiem H2O (Fisher Scientific, Waltham, MA) durch 10-minütige Inkubation bei 55 °C in einem Wärmeblock resuspendiert. Die RNA wurde behandelt, um restliche DNA durch Zugabe von Turbo DNase (Invitrogen, Waltham, MA) gemäß den Anweisungen des Herstellers zu entfernen. Die RNA wurde dann wie oben beschrieben einer zweiten Runde von Fällungs-, Wasch-, Trocknungs- und Resuspensionsschritten unterzogen. Die RNA wurde mit einem Qubit 2.0-Fluorometer mit einem Qubit BR RNA-Kit (Invitrogen) quantifiziert und die Qualität mit einem NanoDrop ND-1000-Spektrometer (Thermo Scientific) getestet. Die DNA-Kontamination wurde überprüft, indem eine PCR-Amplifikation mit archaeenspezifischen 16S-rRNA-Primern durchgeführt und durch Gelelektrophorese sichergestellt wurde, dass keine Amplifikation stattgefunden hatte. Die RNA wurde dann zur Qualitätskontrolle, rRNA-Depletion unter Verwendung maßgeschneiderter Methanococcus-spezifischer Oligonukleotide (Ergänzungstabelle 5) und Sequenzierung auf einem Illumina NovaSeq 2×150 bp (Illumina, San Diego, CA) an das Genome Expression Center der University of Wisconsin geschickt.

RNA-Paired-End-Reads wurden mit den Standardeinstellungen in TrimGalore verarbeitet! (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/), ein Wrapper, der CutAdapt88 implementiert, um Adaptersequenzen und FastQC zu entfernen (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc /), um Lesevorgänge zu filtern. Die Lesevorgänge wurden mithilfe von BowTie289 auf das Referenz-MmS2-Genom (ASM1158v1) ausgerichtet. Transkriptionsprofile wurden durch Lesezählung für jeden Locus mit HTSeq90 generiert, dann normalisiert und in DESeq291 analysiert, das in R v3.6.0 implementiert wurde. Die in diesem Artikel gemeldeten RNA-Sequenzierungsdaten wurden in der NCBI GEO-Datenbank (GSE216895) hinterlegt.

Es wurden doppelte Kulturen von MmS2 gezüchtet (siehe oben) und gepoolt, um ausreichend Probenmasse für Isotopenanalysen von Zellbiomasse und CH4 bereitzustellen. Die Kulturen wurden mit Fe(II)/HS- oder FeS2 unter N2-fixierenden oder NH3-veränderten Bedingungen gezüchtet und während der späten logarithmischen Wachstumsphase geerntet. Die Konzentrationen von CH4 wurden von jedem Duplikat bestimmt und die Zelldichten wurden bestimmt, nachdem die Duplikate kombiniert wurden. Die Kulturen wurden in einer anaeroben Kammer geerntet, nachdem sie durch 30-minütige Zentrifugation in 50-ml-Zentrifugenröhrchen (Globe Scientific, Mahwah, NJ) bei 4696 x g und 4 °C > ~3 × 107 Zellen pro ml erreicht hatten. Der Überstand wurde mit einem Schlauch und einer Nadel unter niedrigem Vakuum entfernt und die Zellen wurden in 8 ml Basalmedium resuspendiert und in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen (Globe Scientific) überführt.

Um FeS2 in großen Mengen (falls vorhanden) zu entfernen, wurde die Probe mit einer Arbeitslösung von Percoll (GE Healthcare, Chicago, IL) mit 0,4 M NaCl gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung einer Spritze und einer Kanüle unterschichtet. Anschließend wurden die Proben 20 Minuten lang bei 2000 x g in einem Ausschwingrotor bei 4 °C geschleudert. Die darüber liegende wässrige Phase, die Zellen enthielt, wurde mit einer Pipette entfernt und in ein sauberes 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt, zu dem etwa 40 ml frisches Basalmedium hinzugefügt wurden, und die Röhrchen wurden durch Vortexen gemischt. Die Röhrchen wurden dann 30 Minuten lang bei 4696 x g und 4 °C zentrifugiert, um die Zellen von jeglichem restlichen Percoll zu pelletieren. Der Überstand wurde dann durch Vakuum entfernt und die Zellpellets wurden in 1,5 ml Basalmedium resuspendiert und in 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss (Thermo Scientific) überführt. Eine Teilprobe (10 µL) der Zellen wurde entnommen und nach der Verarbeitung zur Zellzählung verdünnt. Die Biomasse wurde durch 20-minütige Zentrifugation bei 15.000 x g und 4 °C in einem Festwinkelrotor konzentriert und der Überstand mit einer Pipette entfernt.

Die Zellpellets wurden bei –80 °C eingefroren, bis sie zur Analyse stabiler C- und N-Isotope an die Utah State University Geosciences geliefert wurden. Zellpellets wurden durch 16-stündige Inkubation bei 60 °C in einem Trockenofen aerob getrocknet. Nach dem Trocknen wurde die Biomasse aus den Röhrchen gekratzt, gewogen und durch Mahlen zu einem Pulver und Überführen in Zinnkapseln weiter für die Analyse vorbereitet. Anschließend wurde eine Isotopenanalyse der δ15N- (gegenüber LUFT) und δ13C- (gegenüber VPDB) Werte durch Verbrennung und Gaschromatographie der Biomasseproben bei 1000 °C unter Verwendung eines Costech 4010 Elementaranalysators in Verbindung mit einem Thermo Scientific Delta V Advantage Isotopenverhältnis-Massenmessgerät durchgeführt Spektrometrie (GC-IRMS). Für die δ13C-Analyse von CH4 wurden Gasproben aus Kulturen, die in den oben genannten Isotopenexperimenten verwendet wurden, an die Northern Arizona University geschickt und auf einem Picarro G2201-I Cavity-Ring-Down-Spektrometer analysiert. Ein kommerzieller δ13C −60‰ (vs. VPDB) CH4-Standard (Airgas, Plumsteadville, PA) diente als Kalibrierungsstandard zusätzlich zu methanfreier Luft „Nullluft“ für Picarro-Analysen.

Alle angezeigten Daten sind Mittelwerte von mindestens drei unabhängigen Replikaten, wobei Fehlerbalken die Standardabweichung der Replikate zeigen. Die t-Tests von Independent Student wurden verwendet, um die hier angegebenen p-Werte für alle Experimente zu berechnen, mit Ausnahme der Transkriptomik-Experimente, für die die p-Werte durch einen Wald-Test bestimmt wurden, der im in R implementierten DEseq2-Paket berechnet wurde. Die Ergebnisse wurden als signifikant unterschiedlich angesehen, wenn p < 0,05.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Materialien enthalten. Numerische und Replikatdaten, die für alle Abbildungen verwendet werden, finden Sie in den Zusatzdaten 1. Sequenzierungsdaten aus Transkriptomik-Experimenten sind über den NCBI Gene Expression Omnibus unter der Zugangs-ID GSE216895 verfügbar. Alle weiteren Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde von der Abteilung für chemische Wissenschaften, Geowissenschaften und Biowissenschaften, Büro für grundlegende Energiewissenschaften des US-Energieministeriums, durch den Zuschuss DE-SC0020246 an RLS und ESB unterstützt

Abteilung für Mikrobiologie und Zellbiologie, Montana State University, Bozeman, MT, 59717, USA

Devon Payne, Rachel L. Spietz und Eric S. Boyd

Abteilung für Geowissenschaften, Utah State University, Logan, UT, 84322, USA

Dennis L. Newell

Zentrum für Ökosystemwissenschaft und Gesellschaft und Abteilung für Biowissenschaften, Northern Arizona University, Flagstaff, AZ, 86011, USA

Paul Dijkstra

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DP: trug zum experimentellen Design, zur Durchführung von Experimenten und zum Verfassen des Manuskripts bei. RLS: trug zum experimentellen Design, zur Durchführung von Experimenten und zum Verfassen des Manuskripts bei. DLN: trug zum experimentellen Design, zur Durchführung von Experimenten und zum Verfassen des Manuskripts bei. PD: trug zum experimentellen Design, zur Durchführung von Experimenten und zum Verfassen des Manuskripts bei. ESB: trug zum experimentellen Design und zum Verfassen des Manuskripts bei.

Korrespondenz mit Eric S. Boyd.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Masaru Nobu, Tom Jilbert und dem anderen anonymen Gutachter für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptherausgeber: Anna Heintz-Buschart und David Favero.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Payne, D., Spietz, RL, Newell, DL et al. Einfluss von Sulfid auf das diazotrophe Wachstum des Methanogens Methanococcus maripaludis und seine Auswirkungen auf die Entstehung der Nitrogenase. Commun Biol 6, 799 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05163-9

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Eingegangen: 10. Dezember 2022

Angenommen: 21. Juli 2023

Veröffentlicht: 31. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05163-9

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