Genotypisiertes funktionelles Screening löslicher Fab-Klone ermöglicht dies

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13107 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Monoklonale Antikörper (mAbs) und ihre Fragmente werden häufig in der Therapie, Diagnostik und Grundlagenforschung eingesetzt. Obwohl Display-Methoden wie das Phagen-Display einen hohen Durchsatz bieten, müssen die Affinitäten einzelner Antikörper im löslichen Format genau gemessen werden. Wir haben eine Screening-Plattform entwickelt, die in der Lage ist, genotypisierte Funktionsdaten von insgesamt 9216 löslichen, individuellen Antigen-Bindungsfragment-Klonen (Fab) bereitzustellen, indem wir Next-Generation-Sequencing (NGS) mit hierarchischer Indizierung einsetzen. Gepaarte Sequenzen der variablen Domäne in voller Länge (VL–VH) werden mit funktionellen Screening-Daten verknüpft, was eine detaillierte Analyse der Mutationseffekte ermöglicht. Die Plattform wurde auf vier durch Phagendisplay ausgewählte scFv/Fab-Screening-Projekte und ein Projekt zur Standortsättigung der VH-Affinitätsreifung angewendet. Das genotypisierte funktionelle Screening ermöglichte gleichzeitig die Identifizierung von affinitätsverbessernden Mutationen in der VH-Domäne von Fab 49A3, die das Dengue-Virus-Nichtstrukturprotein 1 (NS1) Serotyp 2 erkennen, und informierte über VH-Restpositionen, die gegenüber dem Wildtyp nicht geändert werden können, ohne die Affinität zu verringern. Die genotypbasierte Identifizierung offenbarte uns das Ausmaß der intraklonalen Signalvarianz, die Einzelpunkt-Screeningdaten innewohnt, ein Phänomen, das auf diesem Gebiet oft übersehen wird. Darüber hinaus eliminierte das genotypisierte Screening die redundante Auswahl identischer Genotypen für weitere Untersuchungen und stellte ein neues Analysetool zur Bewertung des Erfolgs der Phagen-Display-Selektionen und der verbleibenden klonalen Diversität in den gescreenten Repertoires bereit.

Das rekombinante Antikörper-Engineering ist eine Erfolgsgeschichte im Bereich der Biotechnologie. Monoklonale Antikörper (mAbs) und ihre Fragmente, wie das Single-Chain-Variable-Fragment (scFv) und das Fragment Antigen-Binding (Fab), werden häufig in der Therapie, in der Diagnostik und als Werkzeuge für die Grundlagenforschung eingesetzt1. Da neue Zielmoleküle für diese Anwendungen entdeckt werden, werden neue oder verbesserte Bindemittel mit hoher Affinität, Spezifität und gewünschten physiochemischen Eigenschaften benötigt.

Die geringere Größe der Antikörperfragmente und das Fehlen der Fc-Domäne bieten im Vergleich zu IgG in voller Größe mehrere Vorteile, darunter eine bessere Gewebedurchdringung2,3 und eine geringere Wahrscheinlichkeit von Störungen bei In-vitro-Diagnosetests4. Aus Sicht des Antikörper-Engineerings besteht der Hauptvorteil der einfachen Struktur von Antikörperfragmenten in ihrer wirtschaftlichen und einfachen Expression in E. coli, was ihre Verwendung im Phagen-Display5 ermöglicht. Fortschrittliche rekombinante Antikörper-Genbibliothekstechnologien6,7 in Kombination mit Hochdurchsatz-Displaymethoden bieten eine effiziente Möglichkeit, Bindemittel gegen eine Vielzahl von Zielen anzureichern8.

Obwohl die Display-Methoden einen hohen Durchsatz haben, müssen die Affinität und Spezifität einzelner Bindemittel durch Screening einer großen Anzahl einzelner Antikörper in löslichem Format beurteilt werden. In einigen Studien wurde über einen Verlust der Spezifität berichtet, nachdem Phagen-präsentierte Antikörperfragmente in ein lösliches Format umgewandelt wurden9,10. Dies könnte durch eine veränderte Konformation des scFv nach dem Verlust der Unterstützung durch das pIII-Protein erklärt werden, das der häufigste Fusionspartner von scFv für Display10 ist. Es gibt auch Berichte über einen Affinitätsverlust nach der direkten Umwandlung vom scFv- in das IgG-Format11,12, was die Anwendungsbereiche der entdeckten Antikörper stark einschränkt. Darüber hinaus führt eine unbeabsichtigte Multimerisierung von scFvs zu einer stärkeren Bindung durch Aviditätseffekte, was beim Panning oder beim Screening löslicher Substanzen nicht erwünscht ist13,14. Fabs gelten jedoch im Allgemeinen als Monomermoleküle, was das ideale Screening-Format für Affinitätstests darstellt, und obwohl die Existenz von Phagenpartikeln mit mehreren präsentierten Fabs nicht ausgeschlossen werden kann, ist das Risiko einer Anreicherung aufgrund von Aviditätseffekten bei Fab geringer als bei scFv Phagenbibliotheken13. Zusätzlich zur zuverlässigen Affinitätsschätzung ermöglicht das lösliche Screening die Identifizierung von Klonen mit guten Expressionsniveaus.

Enzyme-linked Immunoassays (ELISA) und Sanger-Sequenzierung werden häufig beim Antikörper-Screening und bei der Charakterisierung eingesetzt15,16,17. Nach dem primären Screening kann die vielversprechendste Bindemittelteilmenge direkt verwendet oder durch Affinitätsreifung weiter verbessert werden18,19,20. Während ELISA-Methoden relativ leicht skaliert werden können, wird die Sequenzierung der gescreenten Proben durch Sanger-Sequenzierung schnell unwirtschaftlich (fester Probenpreis, für unser Labor zum Zeitpunkt des Verfassens dieses Artikels zwischen 4 und 6 €, einschließlich DNA-Reinigung mit). Thermo GenJet Miniprep Kit) und mit zunehmender Probengröße aufwändig. Traditionell werden nur eine Handvoll gescreenter Klone vor der weiteren Charakterisierung sequenziert15,16,17 und oft werden dieselben angereicherten Klone mehrmals sequenziert. Darüber hinaus führt die Auswahl von Kandidatenklonen auf der Grundlage eines einzelnen ELISA-Datenpunkts aus Screening-Assays dazu, dass die Analyse anfällig für Verzerrungen ist, die durch Signalschwankungen verursacht werden, z. B. durch Expressionsunterschiede. Die Kombination von Geno- und Phänotypen bereits in der Screening-Phase würde intraklonale Signalvariationen offenlegen und unnötige, wiederholte Expression und Sequenzierung vermeiden. Der Einsatz von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien (z. B. Illumina) mit verschachtelter, vierfacher Indexmarkierung21,22,23 ermöglicht die Sequenzierung Tausender einzelner Proben in einem einzigen Sequenzierungslauf. Aufgrund eindeutiger Tags können Proben zur Bibliotheksvorbereitung zusammengefasst werden, wodurch der Preis pro Probe mit zunehmender Anzahl der Proben erheblich sinkt.

NGS wurde bereits umfassend im Antikörper-Engineering24 eingesetzt, z. B. um die Qualität synthetischer Antikörperbibliotheken25 zu bewerten und den primären Screening-Schritt zu umgehen, indem die Anreicherung von Antikörpersequenzen zwischen den Selektionsrunden beobachtet wurde26. Die mit NGS gewonnenen Erkenntnisse wurden auch zur Entwicklung neuartiger Antikörper mit verbesserter Stabilität27, Selektivität und Affinität28 genutzt. Während sich die meisten aktuellen Studien auf die Sequenzierung von Antikörper-Bibliothekspools konzentrieren, wurde NGS auch zur Sequenzierung einzelner FACS-sortierter Hybridomzell-Antikörperklone mittels PCR-Barcoding eingesetzt29.

Hier haben wir eine automatisierungsfähige lösliche Fab-Screening-Plattform entwickelt, die genotypbezogene funktionelle Bindungsdaten von Tausenden einzelner Fab-Klone liefert. Illumina NGS wird mit verschachtelter, vierfacher Indizierung verwendet, um Gene mit variabler Domäne von bis zu 9216 funktionell gescreenten Klonen zu sequenzieren. Die verschachtelten Barcodes verknüpfen die Sequenzen mit ihren physischen Positionen auf den ELISA-Screeningplatten. Die äußeren Barcodes geben die Plattennummer an, während die inneren Barcodes die Well-Koordinaten angeben. Um die Gene der variablen Fab-Region mit kurzer Lesesequenzierung vollständig zu sequenzieren und die VH-VL-Verknüpfung aufrechtzuerhalten, werden beide Domänen mit identischen internen (Well-)Indizes markiert und im Paired-End-Modus (301 + 301 Basen aus jeder Richtung) sequenziert. Unsere Hypothese war, dass durch die Verwendung von NGS parallel zum funktionellen Screening vollständige Geno-Phänotyp-Karten aus ortsspezifischen Screening-Daten der Mutantenbibliothek erstellt werden könnten. Anhand der Funktionsdaten können wirklich einzigartige Klone identifiziert werden, was die Genauigkeit des Screenings erhöht und die Auswahl wiederholter Genotypen für eine detailliertere Charakterisierung vermeidet. Außerdem wird eine retrospektive Qualitätsanalyse der Auswahl und Bibliotheksvorbereitung ermöglicht.

Um eine robuste, kosteneffiziente und automatisierungsfähige Fab-Screening-Plattform zu schaffen, die in der Lage ist, genotypbezogene Funktionsdaten von Tausenden von Klonen massenhaft bereitzustellen, wurde eine hierarchische Vierfach-Index-Barcoding-Strategie entwickelt. Ausgehend von einer mit Phagendisplay angereicherten Fab-Bibliothek, die in E. coli exprimiert wurde, wurden einzelne Kolonien von Agarplatten bis zu einer ersten PCR-Reaktion auf 96-Well-Platten und von dort zu entsprechenden Well-Koordinaten auf Expressionsplatten mit Kulturmedien inokuliert. Im ersten PCR-Schritt werden die Gene der VH- und VL-Domäne in derselben Reaktion mit benutzerdefinierten Primern amplifiziert (Tabelle 1), die eindeutige Indexpaare für jede Vertiefung und einen Überhang für die Illumina TruSeq-Indexierungsprimer-Hybridisierung enthalten. Nach der PCR mit Well-Indexierung können die Proben einer einzelnen Platte gepoolt und als eine Probe gereinigt werden. In einem zweiten PCR-Schritt werden die Plattenindizes mit Illumina TruSeq-Indexierungsprimern hinzugefügt, woraufhin alle Proben erneut gepoolt und in einem einzigen Batch gereinigt werden können. Nach der Größenauswahl und Quantifizierung kann die Bibliothek auf einem Illumina MiSeq-Sequenzer sequenziert werden. Parallel dazu wird ein funktionelles Screening der Fab-Klone auf 96-Well-Platten durchgeführt, was zu Antigenbindungsdaten führt. Die aktuelle Plattform verfügt über die Kapazität, insgesamt 9216 Bohrlöcher durch hierarchische Indizierung zu kodieren. Da jede 96-Well-Platte drei Positivkontrollen und drei leere Wells enthielt, wurden in dieser Studie 8640 neue Fab-Klone in einem einzigen Illumina-Lauf sequenziert. Aus denselben Bibliotheken ausgewählte positive Kontroll-Fabs wurden einbezogen, um zu zeigen, ob die Expression auf dieser Platte erfolgreich war. Die drei leeren Vertiefungen dienten auch als Negativkontrollen für die Well-Barcoding-PCR, und die Abwesenheit von Amplifikationsprodukt wurde durch Agarosegelelektrophorese von ein bis drei zufällig ausgewählten Platten aus jedem Screening-Projekt überprüft (Daten nicht gezeigt). Die entworfene Screening-Strategie ist in Abb. 1 dargestellt. Unter Berücksichtigung der Kosten für Primer, DNA-Reinigung, Bibliotheksvorbereitung, Qualitätskontrolle und Sequenzierung mit dem MiSeq v3-Kit betrug der Preis pro Probe/Well 0,35 €. Im Vergleich dazu hätte die Sanger-Sequenzierung etwa 8,5 € pro Probe gekostet, wenn sowohl VL- als auch VH-Domänen getrennt sequenziert worden wären.

Screening-Strategie dargestellt. Einzelne Klone werden zunächst in eine gut barkodierte PCR-Reaktion und dann in die entsprechenden Koordinaten auf der Expressionsplatte geimpft. Die variablen Domänen aller Klone werden mit benutzerdefinierten Well-Index-Primern amplifiziert, anschließend werden alle 96 Proben in einer einzigen Charge gepoolt und gereinigt. Bei der Platten-Barcoding-PCR werden gepoolte Proben aus verschiedenen Platten mit TruSeq-Indexadaptern markiert. Die Proben werden erneut gepoolt, stapelweise gereinigt und für die Sequenzierung auf MiSeq vorbereitet. Parallel dazu (rechts) wird ein funktionelles Screening einzelner Fab-Klone durchgeführt. Die resultierenden Immunoassay-Daten werden dann mit NGS-Daten kombiniert, wirklich einzigartige Klone identifiziert und die besten Kandidaten für ein gründlicheres Affinitätsscreening ausgewählt.

Vor der Anwendung der Strategie auf Screening-Projekte wurden die indizierenden PCR-Reaktionen mit Kontroll-Fab-DNA getestet und optimiert, um in optimalen Reaktionsvolumina von 10 μl zu funktionieren, um kosteneffizient und dennoch praktisch für die Handhabung von Flüssigkeiten durchführbar zu sein. Kontroll-Fab-Sequenzen wurden mit Sanger-Sequenzierung auf ihre Richtigkeit überprüft und enthielten alle vier Indizes und Illumina TruSeq-Adaptersequenzen (Abb. S1). Darüber hinaus zeigte die Gelelektrophoreseanalyse, dass alle 96 + 96 indizierenden Primerpaare mit ähnlicher Amplifikationseffizienz arbeiteten (Abb. S2), was ein einfaches volumetrisches Pooling der Proben ermöglichte. Darüber hinaus konnten sowohl VL- als auch VH-Sequenzen in einer einzigen PCR mit zwei Primerpaaren amplifiziert werden. Die korrekte Amplifikation für die VH- und VL-Barcodierung wurde erneut durch Elektrophorese nach PstI-Verdau des VL-Amplifikats zur besseren Trennung der VH- und VL-Fragmente überprüft (Abb. S3).

Mit der entwickelten Plattform wurden Antikörper-Fab-Fragmente gegen vier verschiedene Antigene (SpyCatcher, DARPin, Dengue-Virus-Nichtstrukturprotein 1 (NS1) und SARS-CoV-2-Nukleokapsidprotein (NP)) gescreent. Mit Ausnahme der Anti-NS1-Bibliothek stammten die Fabs aus Phagen-Display-Selektionen aus unseren beiden synthetischen scFv-Bibliotheken. Die Selektionen wurden mit drei bis vier Runden Phagen-Panning als scFvs begonnen, gefolgt von der Konvertierung in Fab-Bibliotheken. Die Konvertierung beinhaltete einen Mischschritt für variable leichte (VL) und variable schwere (VH) Paare, da die Domänen zunächst separat aus scFv-Phagen-Ausgabepools amplifiziert und dann mit Restriktionsenzymen vom Typ IIS oder selektivem RCA in Fab-Kassetten kloniert wurden. Nach drei bis vier weiteren Runden der Phagen-Display-Selektion wurden die angereicherten Fab-Bibliotheken mit dem Restriktionsenzym Typ IIS in einen Expressionsvektor kloniert, von dem aus die Fabs als lösliche periplasmatische Proteine ​​mit einem His-Tag am C-Terminus des Heavy exprimiert wurden Kette. Expression und funktionelles Screening mit Antigenbindungsimmunoassays wurden auf 96-Well-Platten durchgeführt. Die Antigenkonzentration für das lösliche Screening wurde auf der Grundlage von Tests ausgewählt, die mit Kontroll-Fabs aus früheren Studien durchgeführt wurden und 20 % des maximalen Signals im Antigen-Sättigungsbindungstest lieferten. Zwanzig Platten wurden sowohl aus Anti-SpyCatcher- als auch aus Anti-DARPin-Bibliotheken gescreent. Die Anti-NP-Bibliothek wurde nach der Fab-Konvertierung in zwei Unterbibliotheken aufgeteilt. Die erste Unterbibliothek, später als „NP-1“ bezeichnet, wurde zwei Runden lang mit Phagen-Display angereichert, um das von biotinyliertem Fab N1G1 (Klon, der beim Vorscreening der Bibliotheken gefunden wurde) eingefangene Antigen zu binden. Die zweite Unterbibliothek, später als „NP-2“ bezeichnet, wurde über Phagendisplay für zwei Runden direkt gegen biotinyliertes Antigen angereichert. Achtzehn Platten aus beiden NP-Bibliotheken wurden gescreent.

Anders als in den anderen drei Projekten wurden Anti-NS1-Fabs keiner Phagen-Display-Selektion unterzogen. Der Grundgedanke bestand darin, das Spezifitätsprofil eines vorhandenen Anti-NS1-Fab 49A3 zu erweitern, um alle NS1-Serotypen 1–4 einheitlicher zu erkennen. Zu diesem Zweck konzentrierten wir uns auf das Screening von parentalen Anti-NS1-Fab-49A3-Varianten, die einzelne Substitutionsmutationen gegen das Dengue-NS-Serotyp-2-Antigen enthielten, das vom parentalen Fab im Vergleich zu den anderen drei Serotypen mit der geringsten Affinität erkannt wurde (Daten nicht gezeigt). Die NS1-Screening-Kampagne wird in den späteren Abschnitten unten ausführlich analysiert. Bei allen vier Screening-Projekten enthielt jede gescreente Platte drei Kontroll-Fab-Vertiefungen (ähnlich wie gescreente Klone aus Kolonien beimpft) und drei leere Kontrollvertiefungen.

In allen vier Screening-Kampagnen ergaben Negativkontrollvertiefungen im Vergleich zwischen verschiedenen Platten ein gleichmäßiges, niedrig zeitaufgelöstes Fluoreszenzsignal (TRF). Die positiven Fab-Kontrollvertiefungen zeigten in allen Bibliotheken innerhalb derselben Platte ein ähnliches, einheitliches Signal, mit Ausnahme von Anti-DARPin, wo eine hohe Varianz zwischen den drei positiven Kontrollen innerhalb der Platten beobachtet wurde. Die Datennormalisierung erfolgte somit durch Division des TRF-Signals der gescreenten Klone durch das der leeren Wells (Signal-zu-Hintergrund, S/B). 57 % der gescreenten Klone ergaben einen S/B-Wert von weniger als 3, was entweder auf Wells mit geringer Fab-Expression oder auf Klone mit schlechter Leistung hinweist. Die positiven Trefferquoten bei diesem Grenzwert betrugen 13, 84, 55 bzw. 54 % für die Anti-SpyCatcher-, -DARPin-, -NP-1- und -NP-2-Bibliotheken. Die funktionalen Siebdaten für jedes Projekt sind in Abb. 2 und pro Siebplatte in den Abbildungen dargestellt. S4 und S5.

Screening-Zusammenfassung der ausgewählten Genotyp-Phänotyp-gescreenten Fab-Repertoires durch Phagendisplay. (a) Sturmwolkendiagramme funktioneller Screening-Daten aus Antigenbindungs-Immunoassays für Fab-Bibliotheksklone gegen SpyCatcher, DARPin und SARS-CoV-2 NP, in der jeweiligen Reihenfolge von links nach rechts. Die Antigenbindung wird auf der Y-Achse als zeitaufgelöste Fluoreszenzeinheiten geteilt durch das Signal der leeren Kontrollvertiefung angezeigt. Die relative Verteilungsdichte wird als Halbviolettendiagramm (lila) dargestellt. Median und Quartile werden mit einem Boxplot und der Mittelwert mit einem roten Rechteck angezeigt. Gemessene Daten einzelner Fab-Klone werden mit einem Punkt angezeigt, der positive Treffer (blau) mit einem S/B von mehr als drei von negativen Treffern (orange) trennt. Darüber hinaus sind Kontroll-Fab-Klone grün gefärbt. (b) Prävalenz einzigartiger Genotypen als Kopienanzahl innerhalb jeder gescreenten Bibliothek.

Durch die Sequenzierung mit MiSeq wurden insgesamt 15 Millionen Paired-End-Reads (301 + 301) mit einem durchschnittlichen Phred-Qualitätsscore von 32 pro Read erhalten. 89,5 % der Lesevorgänge wurden basierend auf den TruSeq-Plattenindizes automatisch von der Illumina-Software korrekt demultiplext. Die verbleibenden 10,5 % der Lesevorgänge wurden als unbestimmt markiert und später mit der BLAST-Suche als PhiX-Kontrollsequenzen identifiziert. Dies entsprach der aufgestockten Menge (10 %) der PhiX-Kontrolle. Identifizierte Lesevorgänge waren gleichmäßig auf die Plattenindizes verteilt, wie in Abb. 3a gezeigt, was auf eine gute Eingabenormalisierung durch die DNA-Masse im Schritt der Bibliotheksvorbereitung hinweist. In ähnlicher Weise wurde eine ausgewogene Leseverteilung auf einzelnen Platten zwischen den Well-Indizes beobachtet (Abb. 3b). Lesevorgänge wurden auch mit Kontrollindizes (H10–H12) erhalten, die keine DNA-Matrize enthalten sollten. Es gab durchschnittlich 229 Lesevorgänge pro leerem Well-Index im Vergleich zu durchschnittlich 1540 Lesevorgängen mit Indizes, die sich jeweils auf Wells bezogen, die Plasmid-tragende Bakterien enthielten. Die Lesevorgänge der VL-Domäne waren mäßig häufiger als die der VH. 98 % der gepaarten Lesevorgänge wurden erfolgreich zusammengeführt, wodurch VL- und VH-Domänen voller Länge mit flankierenden Well-Indizes bereitgestellt wurden, was den durchschnittlichen Phred-Qualitätswert pro Lesevorgang auf 37 erhöhte. Nach dem Demultiplexen benutzerdefinierter Well-Indizes und dem Trimmen von Adaptern qualifizierten sich 92 % der Lesevorgänge für VL- und VH-Sequenzanalyse. Die Extraktion von VH- und VL-Sequenzen erfolgte mithilfe von UNIX-Befehlen mit benutzerdefinierten regulären Ausdrucksmustern. Durch die Ausrichtung der Lesevorgänge auf bekannte Kontroll-Fab-Sequenzen wurde der Erfolg der Dual-Index-Sequenzierung weiter bestätigt. Die Sequenzierungsstatistiken sind in Tabelle 2a ausführlicher dargestellt.

Gesamtverteilung der Sequenzanzahl innerhalb der Plattenindizes (a) und mittlere Verteilung der Sequenzanzahl innerhalb der Well-Indizes (b). (a) Innerhalb der Platten wird eine gleichmäßige Verteilung der Gesamtlesezahlen beobachtet. Die Gesamtsequenzzahlen der Anti-NS1-Bibliothek sind etwas niedriger, da nur VH-Domänen sequenziert wurden. Die Bibliotheken SpyC, DARPin, NS1, NP-1 und NP-2 werden jeweils in den Farben Blau, Orange, Grün, Rot und Lila dargestellt. (b) In ähnlicher Weise ist nach dem Demultiplexen eine ausgeglichene mittlere Leseanzahlverteilung innerhalb der Well-Indizes zu sehen. VL-Sequenzen (blau) kommen in den Daten mäßig häufiger vor als VH-Sequenzen (orange). Eine sehr geringe Anzahl an Lesevorgängen stammte aus den Vertiefungen H10–H12, da diese beim Screening als leere Kontrollvertiefungen dienten und keine Fab-exprimierenden E. coli-Klone enthielten.

Zu unserer Überraschung wurden mehrere unterschiedliche Sequenzen beobachtet, die dieselbe Well-ID enthielten, nachdem die Lesevorgänge mit FASTX-Toolkit zusammengefasst wurden. Bei der Mehrzahl der Klone beobachteten wir unterschiedliche einzelne VH- und VL-Sequenzen mit hoher Häufigkeit, von denen wir annahmen, dass es sich um die richtige Sequenz für dieses spezifische Indexpaar handelte. Es blieben jedoch mehrere Proben ohne klare Hauptsequenz übrig (20 % der Proben wiesen weniger als einen zweifachen Unterschied zwischen der am häufigsten und der zweithäufigsten gelesenen Sequenzzahl auf). Die kontaminierenden Hintergrundsequenzen, die ebenfalls aus VH/VL-Sequenzen voller Länge bestanden, zeigten bibliotheksspezifische Muster. Identische Sequenzmotive wurden über verschiedene Well- und Plattenindizes innerhalb derselben Bibliothek hinweg identifiziert, jedoch nicht über sequenzierte Repertoires von Fabs gegen verschiedene Antigene hinweg. Es wurden auch völlig neue Amplikons mit der richtigen Größe entdeckt, die nicht als Haupt-VH- oder VL-Sequenz eines Klons identifiziert wurden, was die Theorie der PCR-Chimärenbildung weiter stützt. Die Chimären können während der Platten-Barcoding-PCR entstehen, bei der alle 93 DNA-Klone als Matrizen in derselben Reaktion vorhanden waren, und können sich aufgrund der hohen Sequenzähnlichkeit gegenseitig vorbereiten und neue Varianten erzeugen. Wir haben die PCR weiter optimiert, indem wir die Polymerase von Phusion auf Q5 umgestellt und die Anzahl der Zyklen von ursprünglich 20 auf acht gesenkt haben. Nach der Neusequenzierung wurde eine deutliche Verbesserung der Sequenzklarheit beobachtet. Beim Ausschluss der Leerbrunnen-Indizes aus den Analysen wurde eine durchschnittliche Verbesserung um das 1,3- bzw. 2,5-fache der Anzahl der obersten (Haupt-)Sequenzen zur Gesamtanzahl bzw. der Anzahl der oberen Sequenzen zur zweithäufigsten Sequenzanzahl innerhalb desselben Index beobachtet (Verhältnisse und Faltung). (siehe Abbildungen S6, S7).

Nach der optimierten Barcode-PCR blieb ein gewisser Grad an Hintergrundsequenzen immer noch an allen Indexpositionen bestehen. Die leeren Wells zeigten deutlich niedrigere Lesezahlen für jede variable Domäne (im Bereich von 5 bis 677, mit einem Median von 95) im Vergleich zu den experimentellen Wells (im Bereich von 4 bis 4378, mit einem Median von 720). Darüber hinaus waren die Verhältnisse der am häufigsten vorkommenden Sequenzzahlen zur zweithäufigsten Sequenz in den Probenvertiefungen jeweils durchschnittlich 31-mal höher als in den leeren Vertiefungen. Um eine systematische und objektive Sequenzzuordnung für jede Vertiefung sicherzustellen, wurde eine Filtermethode entwickelt. Die Analyse der gesamten Lesezahlen, die aus einzelnen Vertiefungen einer 96-Well-Platte abgerufen wurden, führte uns dazu, eine Filtermethode zu entwickeln, die auf zwei Kriterien basiert: (1) Das Verhältnis der häufigsten Lesevorgänge zur Gesamtzahl der Lesevorgänge pro Vertiefung ist höher als das entsprechende Verhältnis berechnet aus leeren Well-Kontrollen und (2) das Verhältnis des häufigsten Messwerts zum zweithäufigsten Messwert ist mehr als zweifach. Da die Gesamtsequenzzahlen zwischen den Platten-IDs leicht variierten, wurde der erste Filter für jede Platte einzeln berechnet. Der für den zweiten Filter festgelegte zweifache Schwellenwert wurde auf der Grundlage der durch Sanger-Sequenzierung verifizierten Daten (nicht gezeigt) als zuverlässiger Indikator für die korrekte Sequenzzuordnung zu einem Bohrloch angesehen. Nach den beiden Filtern betrug die Klonzahl der VH- und VL-Sequenzen (oder nur VH für die Anti-NS1-Bibliothek) 6378 (69 % der theoretischen Maximalzahl an Klonen, einschließlich leerer Well-Kontrollen aus allen 96 Screening-Platten). Die Anzahl der beiden Filter, die Klone pro gescreenter Bibliothek passierten (mit Ausnahme der drei Vertiefungen, die zur Kontrolle absichtlich leer gelassen wurden), betrug 1691 (91 %), 1374 (74 %), 1520 (81,7 %), 1143 (68 %) und 1615 (97). %) für Anti-SpyC-, Anti-DARPin-, Anti-NS1-, Anti-NP 1- und Anti-NP 2-Bibliotheken. Als abschließender Filter wurden Sequenzen, die vom Antikörper-Nummerierungstool ANARCI nicht als variable Antikörpersequenzen erkannt wurden, vor der Auswahl der Klone für das EC\(_{50}\)-Screening verworfen. Dies führte zum Ausschluss weiterer 126 Klone, die alle Stoppcodons in einer ihrer übersetzten variablen Domänensequenzen hatten. 80,9 % der Kontroll-Fab-Wells bestanden alle Filter, wobei die Mehrheit der nicht bestandenen Klone zum Anti-DARPin-Projekt gehörten. Die Filterstatistiken sind in Tabelle 2b dargestellt. Ein Beispiel für die Filterung, die auf Sequenzdaten einer Anti-SARS-CoV-2-NP-Screeningplatte mit der Nummer S079 angewendet wird, ist in Abb. 4 dargestellt. Alle Klone auf Platte S079 haben den ANARCI-Filter bestanden.

Um die Genauigkeit der durch Demultiplexierung der doppelt indizierten NGS-Daten und angewandten Filtermethoden erhaltenen Sequenzen zu überprüfen, wurde die 96-Well-Platte mit der Bezeichnung „RS016“, die Anti-SARS-Cov-2-NP-Fab-Klone enthielt, durch Sanger-Sequenzierung sequenziert und die Ergebnisse mit denen verglichen Von NGS abgeleitete Sequenzen. 130 von 156 (83,3 %) Sanger-Sequenzen guter Qualität stimmten vollständig mit den mit MiSeq erhaltenen Sequenzen überein. Unter den nicht übereinstimmenden Sanger-Sequenzen enthielt eine Probe eine Dublettsequenz, die durch die Auswahl zweier überlappender Kolonien von einer Agarplatte entstanden war. Der Rest der durch NGS ermittelten zugeordneten nicht übereinstimmenden Sequenzen wurde als andere Fab-Sequenzen aus derselben Bibliotheksausgabe (19 Klone) identifiziert, was möglicherweise auf eine geringfügige Kreuzkontamination oder einen menschlichen Fehler bei der Kolonieauswahl hinweist. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen der Anzahl der nicht übereinstimmenden Sequenzen in VH (n = 16) und VL (n = 14). Obwohl die Stichprobengröße begrenzt war, deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die überwiegende Mehrheit der Klonsequenzen korrekt ist. Es ist jedoch wichtig anzuerkennen, dass aufgrund der manuellen Handhabung der Platten immer noch die Möglichkeit einer fehlerhaften Sequenzzuordnung besteht. Eine zusätzliche Qualitätskontrolle wurde durchgeführt, indem Sequenzen der Fab-Indexpositionen der internen Positivkontrolle von jeder Screeningplatte mit bekannten Kontroll-Fab-Sequenzen verglichen wurden. Die demultiplexten und annotierten VL- und VH-Sequenzen, die die entwickelte Filtermethode bestanden haben, stimmten perfekt (100 %) mit den bekannten Kontroll-Fab-Sequenzen in allen Bibliotheken überein.

Filterung angewendet auf der Anti-SARS-CoV-2-NP-Screeningplatte S079. Jedes Unterdiagramm stellt eine Vertiefung auf einer Siebplatte dar, dargestellt auf der X- und Y-Achse. Die durch den Filter bestandenen Klone werden in grün und die nicht bestandenen in roter Farbe angezeigt. Die Zahl oben im Unterdiagramm zeigt die Gesamtzahl der Sequenzierungsablesungen, die aus diesen Well-Indizes erhalten wurden. Die Klarheit der VL- (links) und VH-Sequenzen (rechts) wird als Balken angezeigt und zeigt den Anteil der häufigsten Sequenzanzahl (weißer Balken) dieser Vertiefung im Vergleich zur zweithäufigsten Sequenzanzahl (grauer Balken).

Durch die Identifizierung des Genotyps vor der Auswahl einzelner Klone für ein gründlicheres sekundäres Screening wird das Risiko eines wiederholten sekundären Screenings desselben Klons beseitigt, wodurch Ressourcen und Zeit gespart werden. Durch die Auswahl von Klonen basierend auf Einzelpunkt-TRF-Assay-Signalen waren wiederholte Genotypen unter den Top-10-Klonen mit dem höchsten S/B vorhanden. Die Anteile wirklich einzigartiger Klone betrugen 8/10, 1/10, 8/10, 9/10 und 9/10 für die Bibliotheken Anti-SpyC, Anti-DARPin, Anti-NS1, Anti-NP 1 bzw. Anti-NP 2 . Die Anzahl der wirklich einzigartigen Klone war sogar noch geringer, wenn 20 Klone blind ausgewählt wurden, nämlich 15/20, 3/20, 13/20, 12/20 und 14/20 in derselben Reihenfolge. Die Auswahlmöglichkeiten für die Anti-NS1-Bibliothek sind in Abb. 5a, b und für alle fünf Bibliotheken in Abb. 5 dargestellt. S8–S12.

Die erfolgreiche Anreicherung von Bindemitteln gegen das interessierende Antigen kann im Nachhinein mit einem genotypisierten Screening beurteilt werden. Die Anteile einzigartiger VH+VL-Kombinationen betrugen 79, 8, 42 und 41 % der Gesamtzahl der Filter, die Klone für Anti-SpyC-, Anti-DARPin-, Anti-NP 1- und Anti-NP 2-Bibliotheken passieren. In Anti-NP 1- und Anti-NP 2-Bibliotheken war die Anreicherung deutlich sichtbar, da 23 und 42 % der Genotypen zwischen 2 und 65 Mal mit einem Median von 2 bzw. 3 vertreten waren. Aufgrund der großen Sequenzvielfalt der aus der Auswahl der Anti-SpyC-Bibliothek gescreenten Klone war die Anreicherung im Screening-Stadium nicht vollständig, da nur 13 % der Genotypen mehr als einmal in den Daten vertreten waren, von denen die meisten vor 2 Jahren entdeckt wurden. 10 mal. Die Unvollständigkeit der Phagen-Display-Auswahl wurde durch die funktionellen Screening-Daten weiter gestützt, da die gescreenten Anti-SpyC-Repertoires die niedrigste Trefferquote (S/B > 3) unter den ausgewählten Phagen-Display-Bibliotheken aufwiesen. Von den Genotypen, die in der Screening-Kampagne mindestens dreimal vorkamen, banden 66,7 % nicht an das SpyCatcher-Antigen (S/B < 3), wohingegen 28,9 % der übrigen Genotypen ein S/B-Verhältnis sowohl oberhalb als auch unterhalb des SpyCatcher-Antigens aufwiesen Legen Sie ein dreifaches Schwellenverhältnis fest, und 4,4 % waren in allen Fällen positiv (S/B > 3) (6,7 %, wenn berechnet nach S/B > 2). Im Gegenteil, die Anti-DARPin-Bibliothek war im Verhältnis zur Anzahl der gescreenten Klone übermäßig angereichert, mit nur 76 einzigartigen Genotypen, von denen 43 % zwischen dem 2- und 331-fachen mit einer Standardabweichung (SD) von 47 vertreten waren. Drei Genotypen, darunter einer, der als Kontrolle diente, waren mit 170 oder mehr Klonen vorhanden. Die geringe Anzahl einzigartiger Klone im Anti-DARPin-Fab-Repertoire steht im Einklang mit dem Selektionsschema, da mit der Anti-DARPin-Bibliothek vier Runden der Fab-Phagen-Selektion durchgeführt wurden, im Gegensatz zu drei mit der Anti-SpyC-Bibliothek und ein bis zwei mit Anti-NP-Bibliotheken. Die Anzahl der Genotypkopien pro Bibliothek ist in Abb. 2b dargestellt.

Da die Methode die Genotypen aller gescreenten Klone aufdeckt, können die TRF-Signaldaten basierend auf der Klonidentität gruppiert werden. Je größer die Probengröße, desto zuverlässiger ist die quantitative Schätzung der Bindungsstärke des Klons im Vergleich zu Peer-Klonen und desto zuverlässiger ist die Schätzung der Signalschwankung innerhalb des Tests. Durch Analyse der Varianz in der Größe des von identischen Klonen erhaltenen Assay-Signals wurde der Zufallsfehler der Screening-Plattform quantifiziert. Dies ist für Anti-NS1-Klone in Abb. 5b dargestellt. Die intraklonale Variation war in der Anti-DARPin-Bibliothek am höchsten, und bei der Untersuchung der vier am häufigsten vorkommenden Genotypen wurde festgestellt, dass der Varianzkoeffizient (cv) zwischen 40 und 52 % lag (Abb. 5c). Die Möglichkeit, die natürliche Varianz zu erkennen, ermöglicht eine genauere Beurteilung der Präzision des Screenings und ermöglicht daher, fundierte Entscheidungen auf der Grundlage gewichteter Beweise zu treffen.

Um die Signalvariation des intraklonalen Screening-Assays weiter zu untersuchen, wurde ein Schein-Screening einer Platte mit einem einzelnen Klon (Anti-DENV2 NS1 Fab S055B12) und Kontrollen mit dem Standardprotokoll durchgeführt. Die CV-Werte für vom Hintergrund subtrahierte Bindungsassay-TRF-Signale betrugen 12,2, 8,7 und 11,1 % für Antigenkonzentrationen von 30, 50 und 100 ng/ml, wie in Abb. 5d dargestellt. Darüber hinaus untersuchten wir, wie sich die Varianz auf die Zuverlässigkeit der Klonauswahl und -einstufung auswirkt, indem wir eine vereinfachte In-silico-Simulation durchführten. Die Simulation wurde mit zwei Stichprobengruppen gleicher Größe (n = 2–20) durchgeführt, die einer Normalverteilung mit zugewiesenen S/B-Mittelwerten von drei bzw. sechs folgten (um die zuvor festgelegte Trefferratengrenze und eine zweifache Signaldifferenz zu imitieren). ). Die Stichprobengruppen wurden mit einem zweiseitigen t-Test unter dem Einfluss sich ändernder Varianz (5–50 %) verglichen, indem die Simulation 1000 Mal iteriert wurde, um genauere Schätzungen der durchschnittlichen p-Werte zu erhalten. Wie in Abb. S13 gezeigt, reicht eine Stichprobengröße von 3 aus, um zuverlässig einen zweifachen Unterschied (p < 0,05) im Funktionssignal für normalverteilte Daten mit einer Varianz von weniger als 20 % zu unterscheiden. Für eine höhere Varianz, z. B. 40 und 50 % wie beim Anti-DARPin-Screening, bräuchte jede Gruppe Stichprobengrößen von 7 bzw. 11, um den Unterschied zu erkennen. Um beispielsweise einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den mittleren TRF-Signalen der Anti-DARPin-Klone vh4vl42 und vh18vl25 (Varianzen 52,1 bzw. 42,8 %) mithilfe des zweiseitigen t-Tests zu erkennen, war eine Mindeststichprobengröße von 12 erforderlich, verifiziert durch Iterationen mit Zufallsstichproben aus jeder Genotypgruppe.

Auswahl einzelner Fab-Klone für das sekundäre Screening. (a,b) Klonauswahl aus dem Screening der Anti-NS1-Fab-Bibliothek unter Verwendung einer Bio-DENV2-NS1-Konzentration von 50 ng/ml. Die graue Violine stellt die Verteilung der einzelnen Datenpunkte dar. (a) 10 Klone mit dem höchsten Signal-Hintergrund-Verhältnis wurden ausgewählt, ohne ihre Genotypen zu kennen, was dazu führte, dass zwei Genotypen, Y98W und Y98L, zweimal ausgewählt wurden. Im Diagramm werden 300 Klone mit dem höchsten S/B angezeigt. (b) 10 einzigartige Genotypen mit dem höchsten Signal-Hintergrund-Verhältnis wurden ausgewählt, wobei eine wiederholte Selektion vermieden wurde und Variationen innerhalb jedes Klonbindungssignals aus dem TRF-Assay auftraten. (c) TRF-Signalvariation der vier am häufigsten vorkommenden Genotypen beim Screening der Anti-DARPin-Bibliothek. Die Mittelwerte werden als horizontale Linie angezeigt. (d) 96-Well-Mock-Screening mit Anti-DENV2 NS1 Fab S055B12, Demonstration der Bindungssignalvariation aus dem Immunoassay mit Antigenkonzentrationen von 30, 50 und 100 ng/ml. Der durchschnittliche Varianzkoeffizient betrug 10,7 %.

Um zu untersuchen, ob der Aufbau der Anti-NS1-Bibliothek erfolgreich war, wurden Mutationen untersucht und einzigartige Genotypen gezählt. Die Anti-NS1-Bibliothek bestand aus 20 Unterbibliotheken mit jeweils einem einzelnen Codon, das an einer bestimmten Stelle in CDRH2 oder CDRH3 randomisiert war. Eine Platte pro Teilbibliothek wurde mit ähnlichen Kontrollen wie zuvor gescreent. Jede Screening-Platte enthielt drei Fab-Kontrollvertiefungen (ähnlich wie gescreente Klone aus Kolonien beimpft) und drei leere Kontrollvertiefungen. Mutationen wurden an korrekten Positionen in allen Unterbibliotheken gefunden und die Abdeckung jeder einzelnen Aminosäure variierte zwischen 11 und 20. Dies weist auf einen erfolgreichen Aufbau der Unterbibliotheken hin, mit Ausnahme der beiden Zielpositionen H52 und H52A (Kabat-Nummerierung). wo die Diversität geringer war (Amber Stop und Prolin waren überrepräsentiert). Die genotypisierten funktionellen Screening-Daten für jede Unterbibliothek sind in Abb. 6a – d dargestellt.

Das genotypisierte funktionelle Screening ermöglicht eine detaillierte Analyse der Mutationseffekte an jeder Zielposition in der Site-Saturation-Mutagenese-Bibliothek. (a–d) Anti-NS1-Funktionsscreeningdaten, die jede Substitution (Symbol) und jeden Aminosäuretyp (Farbe) für Unterbibliotheken zeigen, die auf CDRH2 (a,c) und CDRH3 (b,d) abzielen. Das gemessene TRF-Signal auf der Y-Achse ist in Bezug auf den leeren Well-Hintergrund (a,b) und auf den Elternklon enthaltenden Wells (c,d) normalisiert. Ein einzelner Datenpunkt der Substitution N58E wurde aus der Unterzeichnung (c) ausgeschlossen (Signal für die Eltern von 8,16). Die Mutationsposition (Kabat) ist auf der X-Achse über dem Fab 49A3-Genotyp der Eltern (kursiv) dargestellt. Die in Nebenplot (e) dargestellten Genotypen sind mit Kreisen, Pfeilen und fett gedruckten Symbolumrissen versehen. Die dunkelblaue gestrichelte Linie in den Unterdiagrammen (c, d) zeigt den Signalpegel des Elternklons an. (e) Offensichtliche Affinitäten ausgewählter Fab-Klone, gemessen mit dem EC\(_{50}\)-Immunoassay.

Die scheinbaren Affinitäten ausgewählter Fab-Klone wurden mit EC\(_{50}\)-Immunoassays gemessen und mit den traditionellen Screening-Daten verglichen. Der auf dem S/B-Wert des herkömmlichen Screenings basierende Klon-Rang hat den Rang auf der Grundlage der EC\(_{50}\)-Werte in keiner der Unterbibliotheken perfekt vorhergesagt (Abb. S14), unabhängig davon, ob die primäre Rangfolge für einzelne offensichtliche Personen erstellt wurde Klone oder identifizierte Genotypen als Gruppe. Im Vergleich zum Eltern-Fab wurden niedrigere EC\(_{50}\)-Werte nur für zwei neue Genotypen, Y98L und Y98F, beobachtet, die beide eine geringfügige 1,37- bzw. 1,24-fache Verbesserung zeigten. Die meisten der verbleibenden Klone zeigten einen EC\(_{50}\), der zwei- bis siebenmal höher war als der der Eltern. Dennoch ermöglicht die Plattform eine schnelle Identifizierung vorteilhafter Mutationen von nachteiligen Mutationen an bestimmten Positionen, wie in Abb. 6 dargestellt. Beispielsweise zeigt die Substitution von Tyrosin durch Leusin an Position H98 eine Verbesserung der Antigenbindung gegenüber dem Kontroll-Fab-Genotyp, was ebenfalls zu sehen ist als Verbesserung der scheinbaren Affinität (siehe Abb. S14). Ebenso können Positionen mit bereits optimalen Resten (H50, H52A, H93-95, H100 und H100A) anhand von Positionen identifiziert werden, die Substitutionen ermöglichen und Raum für mögliche Verbesserungen bieten.

In diesem Artikel beschreiben wir eine lösliche Fab-Screening-Plattform, die in der Lage ist, genotypisierte Funktionsdaten von Tausenden einzelner Bindemittel bereitzustellen, indem sie Next-Generation-Sequencing (NGS) mit hierarchischer Indizierung nutzt. Die Kenntnis jedes Klons anhand seiner variablen Domänensequenz des Antikörpers ermöglicht eine detaillierte Analyse der Mutationseffekte und deckt die intraklonale Varianz in primären Screening-Daten auf. Auf diese Weise kann eine fundiertere Kandidatenauswahl getroffen werden, um die Antikörperentwicklung voranzutreiben. Darüber hinaus können die Bibliotheksqualität und der Erfolg der Vorauswahlauswahl im Nachhinein bewertet werden. Darüber hinaus kann die Auswahl von Klonen mit gemeinsamen Genotypen vermieden werden, was wertvolle Zeit und Ressourcen spart. Mithilfe von Affinitätsreifungsbibliotheken, die mithilfe von Site-Saturation-Mutagenese erstellt wurden, kann unsere Plattform aus genotypisierten Screening-Daten schnell vorteilhafte und nicht vorteilhafte Mutationen an jeder Position aufdecken – etwas, das mit herkömmlichen Screening-Daten nicht möglich wäre. Die Kenntnis der Mutationseffekte bereits zum Zeitpunkt des Primärscreenings kann den Antikörper-Engineering-Prozess deutlich beschleunigen. Die günstigen Substitutionen können entweder einzeln oder durch Kombination weiter untersucht werden, um mögliche additive Auswirkungen auf die Funktion zu erzielen und gleichzeitig nachteilige Mutationen zu vermeiden.

Die positiven Trefferquoten (S/B > 3) und die Verteilung der funktionellen Screening-Daten unterschieden sich zwischen den Phagen-abgeleiteten Screening-Projekten. Obwohl die Anti-SpyCatcher-Bibliothek 4 + 4 Phagen-Display-Runden durchlaufen hat, scheint es, dass sie nicht vollständig angereichert war und möglicherweise von einer zusätzlichen Phagen-Display-Selektionsrunde oder einer Überarbeitung der Selektionsstrategie hätte profitieren können. Die Auswahlkampagne umfasste verschiedene Antigene, darunter chemisch biotinylierte SpyCatcher-, scFv-SpyCatcher- und in vivo biotinylierte Spy- und SdyCatcher-Proteine, mit dem Ziel, die Bindung an den Fänger und nicht an den SA-Biotin-Linker zu verbessern. Die unzureichende Anreicherung wird durch die geringe Anzahl identischer Genotypen im gescreenten Satz und eine relativ niedrige Trefferquote von 13 % belegt. Eine geringe Trefferquote lässt sich auch an der stark bodengewichteten Verteilung der Funktionssignaldaten (Abb. 2) erkennen. In den verbleibenden drei Projekten waren die Trefferquoten höher und auch die gemeinsamen Genotypen häufiger. Im Fall der Anti-DARPin-Bibliothek hätte die Selektion nach der 3. Runde statt nach der 4. Panning-Runde durchgeführt werden können, da nur wenige Genotypen in den Daten vertreten waren, die zudem ein recht gleichmäßig verteiltes Funktionssignal aufwiesen. NP-1 und NP-2 stammen beide aus demselben Ursprung der Fab-konvertierten Phagenbibliothek, aber die Funktionsdaten zwischen ihnen sind sehr unterschiedlich, wobei NP-2 gleichmäßigere Signale zwischen den Klonen verteilt hat. Dies war zu erwarten, da die letzten beiden Auswahlrunden und Testformate unterschiedlich waren. Zunächst wurden NP-2-Fabs an die Vertiefungen gebunden, anschließend wurde biotinyliertes Antigen hinzugefügt und mit Eu-markiertem Streptavidin nachgewiesen, wohingegen NP-1-Fabs ausgewählt wurden, um Antigen zu binden, das vom Kontroll-Fab N1G1 eingefangen wurde, und das Vorhandensein von E. coli- exprimierte Fab-APs wurden mit Europium-markiertem Antikörper gegen alkalische Phosphatase nachgewiesen.

Ein Anti-NS1-Affinitätsreifungsprojekt wurde ausgewählt, um verschiedene Probentypen mit unserer Plattform für genotypisiertes funktionelles Screening zu testen. Mutationen an gezielten, bekannten Positionen zu haben, erleichtert die Datenanalyse und Visualisierung von Mutationseffekten erheblich. Im Rahmen dieser Studie wurde eine einzelne Platte, also 90 unbekannte Klone, pro Substitutionsposition gescreent. Es müssten mehr Klone pro Unterbibliothek gescreent werden, um eine höhere Replikationszahl zu erhalten und die Mutationseffekte unter Berücksichtigung der inhärenten Varianz genauer vorherzusagen.

Nach unserem Kenntnisstand ist dies der erste Bericht über die Verwendung von NGS zur Identifizierung Tausender funktionell charakterisierter Fabs, die in E. coli in löslichem Format produziert werden. Wie bereits erwähnt, wurde NGS im Antikörper-Engineering hauptsächlich auf Sequenzierungspopulationen angewendet, z. B. angereicherte Phagen-Display-Pools25,26,28 oder Populationen aus der FACS-Sortierung27. Da sowohl schwere als auch leichte variable Domänen zur Antigenbindung beitragen, ist die Beibehaltung ihrer Verknüpfung bei der Sequenzierung oft entscheidend. Bei der Verknüpfung von VL und VH sind häufig Kompromisse erforderlich, insbesondere bei der Verwendung von Short-Read-Sequenzierungstechnologien wie Illumina. Mit scFvs wurden CDRs von einem einzelnen Amplikon aus durch Lesen von CDRL1 bis CDRH330 sequenziert, wobei nur Teile der Gerüstregionen beeinträchtigt wurden. Es ist möglich, verknüpfte VL- und VH-Sequenzinformationen von Fab-Klonen mit dem Illumina MiSeq 500-Zyklus-Kit zu erhalten, indem die Sequenzierungsprimer sorgfältig nahe an den CDR-Schleifen positioniert und die Zykluszahlen der Leselängen am gepaarten Ende optimiert werden (Lesung 1: 270 Basen, die VL-CDRs abdecken). + Lesen Sie 2: 230 Basen, die CDRH1 und -H2 abdecken)31. Es besteht jedoch das Risiko, dass wichtige Informationen aufgrund des Verlusts der Basisqualität gegen Ende der MiSeq-Lesevorgänge verloren gehen32. Eine andere Strategie zur Aufrechterhaltung der VH-VL-Verknüpfung wurde von Barreto et al. vorgeschlagen. In ihrer Studie verwendeten sie die Kunkel-Mutagenese, um dazwischenliegende Gerüstregionen zwischen CDR-Domänen zu entfernen und CDRL3–CDRH3 oder CDRL3–CDRH1–CDRH2–CDRH3 zu einzelnen Plasmiden zu kombinieren, wo sie für die Sequenzierung auf Ion Torrent33 amplifiziert werden konnten. Der Kunkel-Ansatz ist immer noch von der Sequenzierungsleselänge abhängig, die die verkürzte Zielgröße abdecken sollte. Auf unserer Plattform werden VL und VH aus verschiedenen Amplifikaten sequenziert, die über hierarchische Index-IDs verknüpft sind (Abb. 1), wobei ein ähnlicher Ansatz verfolgt wird, der im Hybridom-Antikörper-Entdeckungsprozess von Chen et al. demonstriert wurde.29 Eine hierarchische Indexsequenzierung ist jedoch nicht erforderlich auf zwei Amplikons beschränkt sein, da eine benutzerdefinierte Anzahl von Sequenzierungszielen amplifiziert und zur Identifizierung mit den Well-Indizes verknüpft werden könnte.

Aufgrund der Verfügbarkeit und der gesicherten Kompatibilität mit Illumina-Durchflusszellen haben wir uns für die Verwendung der proprietären Indexierungsprimer von Illumina aus dem TruSeq Custom Amplicon-Kit für die Platten-Barcodierung entschieden. Dennoch sollten unsere benutzerdefinierten Indexprimer auch vollständig kompatibel mit den in der Adapterama-Serie22,23,34 beschriebenen iTru-Primern sein, die alle notwendigen Elemente für die Sequenzierung mit universellen Illumina-Sequenzierungsprimern enthalten. Für beide Primerpaare im iTru-System wurden 384 einzigartige Indexsequenzen entwickelt. Somit könnte der Durchsatz unserer Screening-Plattform in Zukunft bei Bedarf von derzeit 9216 auf bis zu 14.155.776 (12 \(\times \) 8 \(\times \) 384 \(\times \) 384 weiter erhöht werden . Im Durchschnitt haben wir 1540 Lesevorgänge aus Indizes erhalten, die sich auf Wells beziehen, die Plasmid-tragende Bakterien enthalten, sodass eine Verzehnfachung der Probengröße immer noch zu 150 oder mehr Lesevorgängen pro Probe führen würde. Dies reicht immer noch für die Genotypidentifizierung aus, vorausgesetzt, dass sich das Verhältnis von dominanter Sequenz zu Hintergrundsequenzen pro Vertiefung nicht ändert. Zweifellos würde eine Erhöhung der Probenzahl eine vollständige Automatisierung der Prozesse erfordern. Die Plattform könnte relativ einfach automatisiert werden, indem handelsübliche Liquid-Handling-Roboter und automatische Koloniepicker oder sogar kostengünstige, maßgeschneiderte Kombinationen verwendet werden, wie von Hartley et al.35 demonstriert.

Während dieser Proof-of-Concept-Studie erfolgte die Kolonieauswahl bis hin zur PCR, Kultivierung und Pipettierung manuell, und wir sind uns des Risikos menschlicher Fehler und ihrer Auswirkungen auf die Screening-Daten bewusst. Hauptfehlerquellen bei der manuellen Handhabung sind typischerweise das zweimalige Beimpfen derselben Vertiefung oder das Überspringen einer Vertiefung entweder in der Kulturphase oder beim Hinzufügen von Template-Material zu den PCR-Platten. In unseren Daten beobachteten wir sowohl eine geringe Anzahl an Lesevorgängen (die den „Leerbrunnen“-Filter nicht bestanden) aus Vertiefungen mit messbarem Funktionssignal, was auf eine geringe Anzahl von Bakterien hinweist, die in die PCR-Reaktion inokuliert wurden, als auch zwei unterschiedliche Klone mit hoher Kopienzahl (die nicht bestanden wurden). der „Klarheits“-Filter), die auch mit Sanger-Sequenzierung aus der gelagerten Kulturplatte verifiziert wurden.

Die Analyse der hierarchisch indizierten Amplikonsequenzen wurde durch das Vorhandensein unerwarteter Hintergrundsequenzen erschwert, die in jeder demultiplexierten Well-Sequenzierungsprobe mit geringer Kopienfrequenz vorhanden waren. Eine genauere Untersuchung der kontaminierenden Messwerte ergab, dass identische Sequenzen über verschiedene Well- und Plattenindizes hinweg gefunden werden konnten, mit dem gemeinsamen Faktor, dass die betreffenden Platten gegen dasselbe Ziel geschwenkt wurden. Die identischen Hintergrundsequenzen wurden nicht aus Repertoires gefunden, die gegen andere Ziele ausgewählt wurden. Dies weist darauf hin, dass sie tatsächlich während der zweiten PCR erzeugt wurden, bei der 96 gut indizierte DNA-Proben aus derselben Platte als Pool mit TruSeq-Indexierungsprimern amplifiziert wurden. Identische Sequenzen konnten natürlich von verschiedenen Platten-IDs aus derselben Panning-Kampagne gefunden werden, da identische Klone in parallelen Screening-Platten vorhanden waren. Darüber hinaus wurden völlig neue VL- und VH-Sequenzen entdeckt. Dies ist ein klarer Hinweis auf die Entstehung von Chimären durch PCR-Rekombination, was ein seit langem bekanntes Problem bei der gleichzeitigen Amplifikation von Sequenzen mit hoher Ähnlichkeit darstellt36,37. Wir milderten die Chimärenbildung, indem wir die Zyklen von ursprünglich 20 auf 8 reduzierten, wie von Lahr et al.38 empfohlen, und die Polymerase von Phusion auf Q5 änderten. Obwohl wir die Klarheit der Hauptsequenz pro Index verbessern konnten, blieb ein gewisses Maß an Hintergrundwissen bestehen. Eine weitere Verringerung der Menge an Template-DNA könnte von Vorteil sein38. Die individuelle DNA-Reinigung der gut mit Barcodes versehenen PCR-Amplikons würde, wie von Chen et al.29 gezeigt, auch zu einer geringeren Anzahl unterschiedlicher Sequenzen für jede Vertiefung führen. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass ein solcher Ansatz die Kosten und den Arbeitsaufwand von Projekten dieser Größenordnung erheblich erhöhen würde. Um die Möglichkeit einer Chimärenbildung in Zukunft weiter auszuschließen, könnten Außenplattenindizes durch Ligation anstelle von PCR mit hoher Genauigkeit unter Verwendung von Typ-II-Restriktionsenzymen hinzugefügt werden, ähnlich wie dies im ersten Indexierungsschritt von Bayona-Vásquez et al.34 durchgeführt wurde.

Eine weitere Indexierungsstrategie umfasst die Erhöhung der Anzahl eindeutiger Indexierungsprimer, wie es von Wittmann et al. durchgeführt wurde. im Jahr 202239. In ihrer Studie wurde das interessierende Gen aus gefrorenen E. coli-Kulturen amplifiziert, wobei eine geringe Anzahl von Zyklen und zielspezifische Primer mit Überhängen für das Indexprimer-Annealing verwendet wurden. Im zweiten PCR-Schritt, der weiterhin für jede Vertiefung separat durchgeführt wurde, wurden die Amplikons mit benutzerdefinierten Indexprimern weiter amplifiziert. Insgesamt wurden 96 eindeutig indizierte Vorwärtsprimer zur Kennzeichnung der Well-Koordinaten und 96 eindeutig indizierte Rückwärtsprimer zur Angabe der Platten-IDs verwendet. Dies ermöglichte die Bündelung von 9216 Einzelproben und die weitere Vorbereitung der Bibliothek in einer einzigen Charge, ähnlich wie bei unserem Ansatz. Nach der Reinigung und Größenauswahl könnte die Probe an einen Sequenzierungsdienstleister gesendet werden, um sie entweder mit anderen Kundenproben mit eindeutigen Illumina-Indizes zu analysieren oder die gesamte Flusszelle zu verwenden, um die Lesetiefe zu erhöhen. Zu den Vorteilen dieses Ansatzes gehören die Eliminierung der Chimärenbildung, da PCR-Reaktionen nur eine einzige Probe enthalten, und die Möglichkeit, einen Sequenzierungs-„Slot“ vom Anbieter zu erwerben, anstatt die gesamte Durchflusszelle zu verwenden.

Obwohl unsere Forschungsgruppe seit über zwei Jahrzehnten routinemäßig das Screening löslicher scFv- und Fab-Klone mit TRF-Immunoassays durchführt40, zeigte uns die Studie zum ersten Mal die tatsächliche Intra-Assay-Variation, die in 96-Well-exprimierten Antikörper-Arrays vorhanden ist. Die intraklonale Variation im Assay-Signal ist höchstwahrscheinlich auf unterschiedliche Expressionsniveaus von Fab-Klonen zurückzuführen. Da alle Klone einzigartig sind, können ihre spezifischen Wachstumsraten voneinander abweichen, was zu einer uneinheitlichen Wachstumsphase bei der Induktion führt, was wiederum zu unterschiedlichen exprimierten Fab-Mengen führt. Darüber hinaus können die exprimierten Fabs je nach Sequenzdetails den Stoffwechsel der Wirtszelle belasten, was zu unterschiedlichen toxischen Wirkungen und Fab-Ausbeuten führt41. Eine recht hohe Varianz wurde auch in kontrollierten Experimenten mit demselben Fab-Klon beobachtet, bei denen der Varianzkoeffizient des TRF-Signals des Antigenbindungsimmunoassays etwa 11 % betrug. Wenn die im Kontrollexperiment gemessene Varianzgröße auf alle Screening-Experimente verallgemeinert werden könnte, wären mindestens drei biologische Replikate erforderlich, um den zweifachen Unterschied im funktionellen Immunoassay-Signal mit hoher Sicherheit zu beobachten, wie unsere simulierten Daten zeigen. Bei Bibliotheken mit geringer Anreicherung können eindeutige Unterschiede zwischen den Genotypen nicht beurteilt werden. Zusätzlich zur Wachstumsrate können auch mehrere verschiedene Personen, die die Ausdrücke und das Funktionsscreening durchführen, die Unterschiede in der Datenvarianz beeinflussen.

Zusammenfassend haben wir eine neuartige lösliche Fab-Screening-Plattform entwickelt, die genotypbezogene funktionelle Bindungsdaten von Tausenden von Bindemitteln in großen Mengen liefert und gleichzeitig die VH-VL-Verknüpfung beibehält. Die Plattform wurde mit vier Screening-Projekten validiert und zeigte ihre Vielseitigkeit bei der Kandidatenauswahl auf der Grundlage der Varianzanalyse und des in Panning-Experimenten erreichten Anreicherungsstadiums. Obwohl unsere Daten ausreichen, um die Plattform zu demonstrieren und zu validieren, ist für ein echtes Hochdurchsatz-Screening und eine bessere Qualität der Screening-Daten zweifellos eine Automatisierung erforderlich. Darüber hinaus könnte die Genauigkeit der Plattform verbessert werden, indem die Indizierung von der E. coli-Kulturplatte aus gestartet wird, anstatt jede einzelne Kolonie von einer Vertiefung in eine andere zu verschieben, zusätzlich zu den oben diskutierten Strategien zur Chimärenminderung.

Es wurde E. coli XL-1 Blue (recA1 endA1 gryA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F' proAB lacI q Z\(\Delta \)M15 Tn10 (Tet r)]), ursprünglich gekauft von Stratagene (USA), verwendet für alle Phagen-Display-Selektionen und Fab-Expression im Screening. Der pEB32x6-Phagemid-Vektor (später „Display-Vektor“) wurde bei der Phagen-Display verwendet. Die Vektoren pLK06H6 und pAK40042 wurden verwendet, um Fabs im löslichen Format für das Screening zu exprimieren. Der pUC19-Vektor (New England Biolabs, USA) wurde für die Sanger-Sequenzierung verwendet. Für die Klonierung wurden die Restriktionsenzyme SfiI, LguI, HindIII und BamHI sowie T4-DNA-Ligase gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet, die alle von Thermo Fisher Scientific, USA, bezogen wurden. Die Transformation zu E. coli erfolgte mittels Elektroporation unter Verwendung von Gene Pulser Xcell (Bio-Rad, USA) bei 1250 V, 25 \(\upmu \)F, 200 Ohm, mit 1 mm Gene Pulse Cuvettes (Bio-Rad, USA). Nach der Elektroporation konnten sich die Zellen in 1 ml SOC-Medium (20 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 0,5 g/L NaCl, 2,5 mM KCl, 10 μM MgCl2, 3,6) erholen g/L D-Glucose, pH 7,0) für 1 Stunde bei 37\(^\circ \)C unter Schütteln bei 300 U/min, gefolgt von der Beimpfung von Agarplatten mit 1 % Glucose und geeigneten Antibiotika (10 \(\upmu \) g/ml Tetracyclin und 25 μg/ml Chloramphenicol für pAK400-Vektoren oder 100 μg/ml Ampicillin für pLK06H). Alle verwendeten Antibiotika wurden von Sigma Aldrich (USA) bezogen.

Es wurden vier separate Fab-Screening-Projekte durchgeführt, um die Leistung der entwickelten Plattform zu demonstrieren. Drei der Bibliotheken zielen auf SpyCatcher43 (später „anti-SpyC“), DARPins44 („anti-DARPin“) oder SARS-CoV 2-Nukleokapsidprotein (bestehend aus zwei Unterbibliotheken, „anti-NP 1“ und „anti-NP 2“) ) wurden aus unseren synthetischen Antikörper-Phagen-Display-Bibliotheken ScFvM und ScFvP6 angereichert. Kurz gesagt, in den Display-Vektor klonierte scFvs wurden unter Verwendung von Magnetkügelchen ausgewählt, in der ersten Runde durch Sättigung des interessierenden Kügelchenoberflächenantigens und in den verbleibenden zwei bis drei Runden mit Antigen in Lösung gemischten Phagen und Gewinnung mit Magnetkügelchen. Nach der scFv-Selektion erfolgte die Umwandlung in Fabs entweder mit selektivem RCA45 (Anti-SpyC) oder einer auf Restriktionsenzymen des Typs II basierenden Methode, ähnlich wie zuvor veröffentlicht46, gefolgt von einer Rückklonierung in den Display-Vektor. Drei bis vier Schwenkrunden wurden wie zuvor erneut im Fab-Format durchgeführt. Nach dem Panning wurden die Bibliotheken in Expressionsvektoren kloniert (pLK06H für Anti-NP1 und pAK400 für den Rest). Die Anti-NS1-Bibliothek war ein Affinitätsreifungsprojekt, das mit Site-Saturation-Mutagenese erstellt wurde (dargestellt in Abb. S15). Kurz gesagt, Anti-NS1-Fab-49A3-DNA (entdeckt am Department of Life Technologies der Universität Turku) wurde als Vorlage verwendet, um insgesamt 20 Unterbibliotheken zu generieren, jede mit einem einzelnen Codon, randomisiert in CDRH2 (9 Unterbibliotheken) oder CDRH3 (11 Unterbibliotheken). -Bibliotheken) unter Verwendung von NNK-Primern, die bei Sigma Aldrich, USA, bestellt wurden. Die generierten Bibliotheken wurden zum Screening direkt in den pAK400-Expressionsvektor kloniert. Ausführlichere Informationen zu Phagen-Display-Selektionen, Fab-Umwandlungen und -Konstruktionen, einschließlich Kontroll-Fab-Sequenzen, finden Sie in ergänzenden Materialien.

Minipreps, Gelextraktionen und PCR-Reinigungen wurden mit GeneJet-Kits (Thermo Scientific, USA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Die Sanger-Sequenzierung wurde als Dienstleistung von Macrogen Inc. (Südkorea) gekauft. Zwei Sätze (für VH und VL) mit 12 Vorwärts- und 8 Rückwärts-Well-Barcoding-Indexprimern, die Hybridisierung mit variablen Domänen, benutzerdefinierte Indizes (mit einem minimalen Bearbeitungsabstand von 3) und benutzerdefinierte Indexadapter-Hybridisierungssequenzen von Illumina TruSeq enthalten, wurden entworfen und bei Sigma Aldrich bestellt ( USA) (siehe Tabelle 1). TruSeq Custom Amplicon Kit-Primer (Illumina Inc., USA) wurden als äußere Indexe für die Platten-Barcodierung verwendet.

Die ersten Tests der Well-Index-Primerpaare wurden unter Verwendung von 1 ng gereinigter Plasmid-DNA des bekannten Anti-Microcystin-Fab 226A2 (entdeckt am Department of Life Technologies der Universität Turku) als Vorlage für die PCR-Amplifikation von VH und VL in 20 \(\) durchgeführt. upmu \)L Reaktionsvolumina. Später wurde das Reaktionsvolumen auf 10 μl gesenkt und die gleichzeitige Amplifikation der beiden variablen Domänen sowohl anhand gereinigter Plasmid-DNA als auch einer einzelnen Fab-exprimierenden XL1-Kolonie als Matrize bewertet. Die Amplifikation wurde mit 1 % Agarosegelelektrophorese bewertet. Die Well-Barcoding-PCR-Reaktion bestand aus 0,025 U/\(\upmu \)L FirePol-DNA-Polymerase (Solis Biodyne, Estland), 1\(\times \) Puffer BD, 1,5 mM MgCl\(_2\), 25 \(\upmu \)M dNTP und 0,2 \(\upmu \)M Primer. Die Thermozyklisierung umfasste 35 Zyklen von 95 °C (30 s), 56 °C (60 s) und 72 °C (60 s) mit einer Temperatur von 95 °C. (^\circ \)C (15 min) anfängliche Denaturierung am Anfang und 72 \(^\circ \)C (4 min) letzter Elongationsschritt am Ende. Die folgende PCR-Reaktion mit Barcode auf der Platte bestand aus 0,02 U/\(\upmu \)L Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, USA), 1\(\times \) Q5-Reaktionspuffer, 200 \(\upmu \)M dNTP und 0,5 \(\upmu \)M Primer und thermische Zyklen betrugen 8 Zyklen von 98 \(^\circ \)C (10 s), 67 \(^\circ \)C (15 s) und 72 \( ^\circ \)C (30 s) mit einer anfänglichen Denaturierung bei 98 \(^\circ \)C (3 min) am Anfang und einem abschließenden Elongationsschritt bei 72 \(^\circ \)C (4 min) am Ende .

Zusätzlich zur Elektrophorese wurde die Genauigkeit der vierfach indizierten variablen Sequenzen von Fab 226A2 einer Sanger-Sequenzierung unterzogen. Zuerst wurden HindIII- und BamHI-Restriktionsstellen mit P5- und P7-Hybridisierungsprimern hinzugefügt (TH260_BamHI-P5: 5\(^{\prime }\)-cggggatccAATGATACGGCGACCACCGAG-3\(^{\prime }\) und TH261_HindIII-P7: 5\ (^{\prime }\)-tgcaagcttCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3\(^{\prime }\)) mit ähnlichem Reaktionsgemisch für Q5 High-Fidelity DNA Polymerase wie zuvor und thermischem Zyklus von 25 Zyklen von 98 \(^\circ \) C (10 s), 69 \(^\circ \)C (30 s) und 72 \(^\circ \)C (30 s) mit einer anfänglichen Denaturierung von 98 \(^\circ \)C (3 min). am Anfang und 72 \(^\circ \)C (4 min) letzter Elongationsschritt am Ende. Amplikons wurden in den pUC19-Vektor kloniert, indem sie mit BamHI und HindIII verdaut wurden, gefolgt von einer Gelextraktion und schließlich einer Ligation mit T4-DNA-Ligase. Die Konstrukte wurden durch Elektroporation in XL1 umgewandelt, gewonnen und wie zuvor beschrieben ausplattiert. Am nächsten Morgen wurden vier Kolonien sowohl von VH- als auch von VL-Platten in 5 ml SB (30 g/L Trypton, 20 g/L Hefeextrakt, 10 g/L MOPS) geimpft, über Nacht gezüchtet, für Minipreps verwendet und DNA verschickt Sequenzierung mit Primer LMB: 5\(^{\prime }\)-ATGTGCTGCAAGGCGATTAAG-3\(^{\prime }\).

Für die lösliche Fab-Expression wurden einzelne XL1-Kolonien von der Agarplatte zunächst in die mit Barcodes versehene PCR-Vertiefung mit 10 μl Reaktionsmischung und von dort in die Primärkultur in die entsprechende Vertiefung auf einer 96-Well-Platte mit 200 μl geimpft. (\upmu \)L SB-Medium (30 g/L Trypton, 20 g/L Hefeextrakt, 10 g/L MOPS), ergänzt mit 1 % D-Glucose und geeigneten Antibiotika, gefolgt von einer Inkubation über Nacht bei 37 \(^\circ \)C, 900 U/min. Nach der Inkubation wurden die Zellen durch viermaliges Eintauchen unter Verwendung eines 96-Well-Replikators in frisches SB, ergänzt mit 0,05 % D-Glucose und Antibiotika, zur Expressionskultur geimpft und bei 37 °C unter Standardschütteln 4 Stunden lang inkubiert. Die ursprünglichen Kulturplatten wurden nach Zugabe von Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 16 % bei −70 °C gelagert. Die Expression wurde durch Zugabe von IPTG auf eine Endkonzentration von 200 \(\upmu \)M und Senkung der Temperatur auf 26 \(^\circ \)C für 16 Stunden induziert. Die Zellen wurden durch 30-minütige Zentrifugation bei 4 °C und 3200 g pelletiert. Das Pellet wurde in Lysepuffer (1 mg/ml Lysozym aus Hühnereiweiß L6876 (Sigma Aldrich, Vereinigtes Königreich), 0,025 U/\(\upmu \)L Pierce Universal Nuclease (Thermo Fisher Scientific, USA) in PBS (20 mM) resuspendiert Natriumphosphat, 300 mM Natriumchlorid, pH 7,4), gefolgt von 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur unter langsamem Rühren und schließlich Einfrieren bei –70 °C. Das Lysat wurde vor dem Immunoassay durch Zentrifugation geklärt.

Die Bindung an das Zielantigen wurde mit zeitaufgelösten Fluoreszenz (TRF)-basierten Immunoassays gemessen. Es wurden Antigenkonzentrationen verwendet, die EC\(_{20}\)-Werte der Kontroll-Fabs darstellen. Die Klone mit den Namen S001E03 und N1G1 wurden als Positivkontrollen für das Anti-SpyC- bzw. Anti-NP1- und 2-Screening verwendet. Sie wurden durch Vorscreening einer einzelnen Platte (93 Klone + 3 leere Kontrollen) entdeckt und auf der Grundlage hoher TRF-Signale ausgewählt, was auf eine spezifische Antigenbindung und angemessene Expressionsniveaus hinweist. Die Fabs 49A3 (der Elternklon für das Anti-NS1-Projekt) und 248G12 (die Positivkontrolle für das Anti-DARPin-Screening) wurden in früheren Projekten am Department of Life Technologies der Universität Turku entdeckt und zeigten gute Expressionsniveaus und Antigene verbindlich (nicht veröffentlicht). Die Kontroll-Fab-Sequenzen, mit Ausnahme von 49A3, sind in Tabelle S3 aufgeführt. Die Immunoassays wurden entweder auf mit Streptavidin (Kaivogen Oy, Finnland) oder Ziegen-anti-Human (Fab-spezifisch, später als „GAH“ bezeichnet) IgG (Sigma Aldrich, USA) beschichteten Platten durchgeführt. GAH-Platten wurden durch passives Beschichten von C12 MaxiSorp-Platten (Thermo Fisher Scientific, USA) hergestellt, ausführlich beschrieben in ergänzenden Materialien. Alle Verdünnungen für Immunassays wurden mit Assay Buffer Red und Waschungen mit Kaivogen Wash Buffer durchgeführt, beides von Kaivogen bezogen. Zum Waschen der Platten wurde das Gerät Delfia Plate Wash (Wallac, Turku, Finnland) verwendet. Alle Inkubationen wurden bei Raumtemperatur unter langsamem Schütteln durchgeführt. Immunoassay-Platten wurden mit dem Victor 1420 Multilabel Counter (Wallac) gelesen.

Für Anti-SpyCatcher-Fabs wurden 100 µl 1:5-Verdünnung des geklärten Lysats pro Vertiefung auf die GAH-Platte gegeben und 1 Stunde lang inkubiert, gefolgt von zwei Wäschen. 100 μl 62,35 nM N1-Europium markierter SpyCatcher (hergestellt und gekennzeichnet am Department of Life Technologies der Universität Turku) wurden hinzugefügt und 1 Stunde lang inkubiert, gefolgt von 4 Wäschen und der Zugabe von 200 μm \)L Delfia-Verbesserungslösung (Kaivogen). Nach 10-minütiger Inkubation wurde TRF gemessen, Victor.

In ähnlicher Weise wurden für Anti-DARPin-Fabs 100 µl 1:5-Verdünnung des geklärten Lysats pro Vertiefung auf der GAH-Platte hinzugefügt und 1 Stunde lang inkubiert, gefolgt von zwei Wäschen. 100 μl 62,7 nM biotinyliertes BiLib DARPin-SpyC (hergestellt und gekennzeichnet am Department of Life Technologies der Universität Turku, siehe ergänzende Materialien) wurden zugegeben und 1 Stunde lang inkubiert, gefolgt von zwei Wäschen und der Zugabe von 100 \(\upmu \)L N1-Europium-markiertes Streptavidin (später SA-Eu, gekauft von BioSpa, Italien und markiert am Department of Life Technologies, Universität Turku). Nach 20-minütiger Inkubation wurden die Vertiefungen zweimal gewaschen und 200 μl Delfia-Verstärkungslösung (Kaivogen) hinzugefügt, gefolgt von 10-minütiger Inkubation und TRF-Messung mit Victor.

Für das Anti-NS1-Fab-Screening wurde biotinyliertes Dengue-Virus-2-Nichtstrukturprotein (Bio-NS1) als Antigen verwendet (erworben von The Native Antigen Company, Großbritannien, und mit EZ-Link NHS-PE\(G_4\)-Biotin mit biotinyliert 12\(\times \) molarer Überschuss an Biotin, gemäß Herstellerprotokoll). Der Immunoassay wurde auf die gleiche Weise wie für Anti-DARPin-Fabs durchgeführt, wobei die Konzentration von Bio-NS1 50 ng/ml betrug. Das Anti-NP-2-Screening wurde ebenfalls auf GAH-Platten mit einem ähnlichen Protokoll durchgeführt, jedoch mit kürzeren Inkubationszeiten für Lysat und Antigen (30 Minuten). SARS-CoV-2-Nukleokapsidprotein mit GST-Tag (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Julkunen, Institut für Biomedizin, Universität Turku, siehe ergänzende Materialien) wurde intern ähnlich wie Bio-NS1 biotinyliert und als Antigen für das Screening in Konzentration verwendet von 10 nM. Der beste Fab-Kandidat, RS016D01, wurde auf der Grundlage einer vorläufigen Screening-Datenanalyse ausgewählt, wie zuvor beschrieben ausgedrückt und mit NiNTA und Größenausschlusschromatographie gereinigt. RS016 wurde ähnlich wie zuvor biotinyliert und als Fänger-Fab für das Anti-NP-1-Screening verwendet.

Im Gegensatz zu anderen Screening-Kampagnen wurde das Anti-NP-1-Screening auf gelben Streptavidin-Platten (Kaivogen Oy, Finnland) abgeschlossen. 60 μl 30 nM bio-RS016 Fab wurden in vorgewaschene Vertiefungen gegeben und 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von 4 μm Waschen und Zugabe von 60 μl 10 nM N-GST-Antigen. Nach einer weiteren 30-minütigen Inkubation und zwei Wäschen wurde eine 1:5-Verdünnung des geklärten Lysats pro Vertiefung hinzugefügt und 30 Minuten lang inkubiert, gefolgt von zwei Wäschen. 60 \(\upmu \)L N1-Eu-markierter polyklonaler Anti-alkalische Phosphatase (AP)-Antikörper (Anti-AP pAb) (LifeSpan Biosciences, Inc., USA, markiert am Department of Biotechnology, University of Turku15) in Konzentration 125 ng/ml wurden pro Vertiefung hinzugefügt, 30 Minuten lang inkubiert und zweimal gewaschen. Die Verstärkung und Messung erfolgte wie oben.

Parallel zum funktionellen Screening der Fabs wurden zwei indizierende PCR-Reaktionen durchgeführt, die auf variable Fab-Domänen abzielten. Eine einzelne Bakterienkolonie von der Agarplatte wurde in ein PCR-Reaktionsgemisch mit 10 μL mit Barcoding-Wells aufgenommen, das auf Armadillo-PCR-Platten mit 96 Wells (Thermo Fisher Scientific, USA) vorbereitet wurde, und von dort zur Expression, wie im vorherigen Unterabschnitt beschrieben. Die Well-Barcoding-PCR bestand aus 0,025 U/\(\upmu \)L FirePol-DNA-Polymerase (Solis Biodyne, Estland), 1\(\times \) Puffer BD, 1,5 mM MgCl\(_2\), 25 \(\upmu \ )M dNTP und 0,2 \(\upmu \)M benutzerdefinierte Indexierungsprimer. Die Thermozyklisierung umfasste 35 Zyklen von 95 °C (30 s), 56 °C (60 s) und 72 °C (60 s) mit einer Temperatur von 95 °C. (^\circ \)C (15 min) anfängliche Denaturierung am Anfang und 72 \(^\circ \)C (4 min) letzter Elongationsschritt am Ende. 5 μL aus jeder Vertiefung wurden gepoolt und mit dem GeneJet PCR-Reinigungskit ansatzweise gereinigt. Nach der Plattenbarcodierung wurde die PCR-Reaktion auch auf Armadillo-Platten mit 96 Vertiefungen bei einem Volumen von 20 μl abgeschlossen. Die ursprüngliche PCR bestand aus 1 ng Template-DNA, 0,02 U/\(\upmu \)L Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Scientific, USA), 1 \(\times \) X PhusionTM HF-Puffer, 200 \(\upmu \)M dNTP und 0,5 \(\upmu \)M Primer mit thermischen Zyklen von 20 Zyklen von 98 \(^\circ \)C (10 s), 72 \(^\circ \)C (40 s) mit ein anfänglicher Denaturierungsschritt bei 98 \(^\circ \)C (3 min) zu Beginn und ein abschließender Elongationsschritt bei 72 \(^\circ \)C (4 min) am Ende. Nach der Entdeckung der Chimärenbildung wurde die PCR-Reaktion wie folgt optimiert; 2 ng Template-DNA, 0,02 U/\(\upmu \)L Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, USA), 1 x Q5-Reaktionspuffer, 200 \(\upmu \)M dNTP und 0,5 \( \upmu \)M-Primer mit thermischen Zyklen von 8 Zyklen von 98 \(^\circ \)C (10 s), 67 \(^\circ \)C (15 s) und 72 \(^\circ \)C (30 s) mit einer anfänglichen Denaturierung bei 98 \(^\circ \)C (3 min) am Anfang und einem abschließenden Elongationsschritt bei 72 \(^\circ \)C (4 min) am Ende. 15 \(\upmu \)L von jeder Probe innerhalb derselben Bibliotheken wurden gepoolt und im Batch gereinigt, ähnlich wie oben. Das verbleibende PCR-Produkt wurde als Qualitätskontrolle verwendet und für die Elektrophoreseanalyse verwendet, indem es 90 Minuten lang auf 1 % Agarosegel bei 70 V laufen gelassen wurde.

Zur Auswahl der Bibliotheksgröße und zur Normalisierung der Eingaben pro Bibliothek und Domäne wurden die vollständig indizierten VH- und VL-Domänengene mit 2 % Agarosegelelektrophorese getrennt, 2 Stunden lang bei 70 V betrieben und anschließend mit dem GeneJet-Gelextraktionskit DNA-extrahiert. Alle resultierenden Proben wurden in gleichen Molverhältnissen zusammengefasst. Die Sequenzierung wurde als Dienstleistung vom Finnish Functional Genomic Center (Turku, Finnland) erworben, wo die Qualität der Bibliothek zunächst mit dem 2100 Bioanalyzer mit High Sensitivity DNA Assay Kit (Agilent, USA) bewertet und mit Qubit (Thermo Fisher Scientific, USA) quantifiziert wurde. Die 9-pM-Bibliothek, ergänzt mit 10 % PhiX Sequencing Control V3 (Illumina, USA), wurde auf MiSeq unter Verwendung des MiSeq Reagent Kit v3 (600-Zyklen) (Illumina) sequenziert.

Nach der Sequenzierung der fünf Fab-Bibliotheksklone wurde die Genauigkeit der Plattform durch Sanger-Sequenzierung einer der gescreenten 96-Well-Platten (Platte RS016 von Anti-NP-2) weiter verifiziert. Zellen aus der Glycerin-Vorbereitungsplatte wurden auf 96-Well-Platten mit frischem SB inokuliert und auf demselben Niveau wie zuvor kultiviert. Am nächsten Morgen wurden 1 µL Zellen in einer PCR-Reaktion verwendet, ähnlich wie bei der Well-Barcodierung, um die Fab-Gene mit den Primern ULa03_20: TCCGGCTCGTATGTTGTGTGG und SAk_06: CGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAG zu amplifizieren. Der Temperaturwechsel betrug 30 Zyklen von 95 °C (30 s), 65 °C (30 s) und 72 °C (2 min) mit einer Temperatur von 95 °C \(^\circ \)C (3 min) anfängliche Denaturierung am Anfang und 72 \(^\circ \)C (4 min) letzter Elongationsschritt am Ende. Die DNA wurde mit dem PureLink Pro 96 PCR-Reinigungskit (Invitrogen, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers gereinigt und mit den Primern WO375: TCACACAGGAAACAGCTATGAC oder HS003: ATCTTCTGCCGACTGCTGCG zur Sequenzierung geschickt. VH- und VL-Sanger-Sequenzen von guter Qualität wurden mit den am häufigsten vorkommenden Sequenzen in jeder Indexposition von NGS verglichen (exakte Übereinstimmung).

Die Qualität der FASTQ-Dateien nach jedem Schritt wurde mit FASTQC47 v0.11.9 in Verbindung mit MultiQC48 v1.11 analysiert. Lesepaare wurden mit PEAR49 v0.9.11 mit den Parametern -v 25 -m 600 -n 400 -q 20 -y 4G -j 6 zusammengeführt und vorgefiltert. Das Demultiplexen von Plattenbarcodes (TruSeq-Indizes) wurde von der Illumina-Software bei der Generierung von Roh-FASTQ automatisch durchgeführt Dateien. Der Ursprung „unbestimmter“ Lesevorgänge wurde mit BLAST50 analysiert. Das Barcode-Demultiplexen sowie die Trennung und Extraktion von VH- und VL-Sequenzen erfolgte durch Durchlaufen zusammengeführter FASTQ-Dateien und Indexlisten mit einem benutzerdefinierten UNIX-Skript unter Verwendung regulärer Ausdrücke. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Dateien in das FASTA-Format konvertiert. Der Indexabgleich wurde mit dem UNIX-Tool agrep51 durchgeführt, um eine Nichtübereinstimmung und die Extraktion variabler Domänen mit egrep zu ermöglichen, beides ist kostenlos in Ubuntu-Repositorys verfügbar. Einzigartige Sequenzen aus jeder Probe wurden mit fastx_collapser von FASTX-toolkit52 reduziert und gezählt. Die Gesamtsequenzzahl und die beiden häufigsten Sequenzzahlen wurden für jede Probe extrahiert und zum Herausfiltern von Proben ohne Fab-Sequenz (Formel 1) oder Hintergrund mit hoher Sequenz (Formel 2) verwendet. Die UNIX-Codes und Skripte, die die Datenanalyse bis zur Filterung beschreiben, finden Sie am Ende der ergänzenden Materialien. Für die Kandidatenauswahl wurden Proben verwendet, bei denen sowohl VH- als auch VL-Sequenzen die Filter passierten. Die Grenzwerte für die Filter wurden auf der Grundlage von Daten aus der Sanger-Sequenzverifizierung der Platte RS016 festgelegt.

Tabellarische Immunoassay- und Sequenzierungsdaten wurden mit Python 3.8 mit den Paketen pandas (v1.4.3), numpy (v.1.22.3), scipy (v1.7.3) analysiert und mit den Paketen matplotlib (v3.5.1) und seaborn (v0) visualisiert. 11.2). DNA-Sequenzen wurden mit dem Seq-Modul aus dem Biopython53-Paket (v1.79) übersetzt und die übersetzten Aminosäuresequenzen mit ANARCI54 (v2020.04.23) bis AbNumber (v0.2.7) nummeriert. Die Loglogistikfunktion mit vier Parametern wurde mit Scipy (v1.8.0) an EC\(_{50}\)-Daten angepasst, um scheinbare Affinitäten abzuschätzen. Alle verwendeten Python-Pakete sind in Anaconda-Repositories frei verfügbar. Der zweiseitige Mann-Whitney-U-Test aus der Scipy-Packung wurde verwendet, um schlechte TRF-Signale des Anti-NS1-Genotyps vom Screening mit dem elterlichen Genotyp zu vergleichen. Zum Vergleich wurden fünf Klone aus verschiedenen Unterbibliotheken ausgewählt.

Die T-Test-Simulation wurde ebenfalls mit Python durchgeführt. Um die Daten zu generieren, wurde die Funktion ttest_ind aus dem Statistikmodul des Scipy-Pakets in einer Schleife mit zufällig generierten Daten mit Normalverteilung unter Verwendung der Normalfunktion aus dem Zufallsmodul von Numpy verwendet. Beide Gruppen wurden mit der gleichen Standardabweichung (berechnet aus dem Lebenslauf) mit Mittelwerten von 3 und 6 (= zweifache Differenz) gebildet. Kurz gesagt wurden Gruppengrößen von zwei bis 20 Personen mit einem CV-Wert zwischen 5 und 50 % in 5 %-Intervallen getestet. Für jede Stichprobengröße:Lebenslauf-Kombination wurden die Daten 1000 Mal neu generiert, gefolgt von der Durchführung eines zweiseitigen t-Tests und der Erfassung von p-Werten aus jeder Iteration. Die für eine statistisch signifikante zweifache Differenz bei gegebener Varianz erforderliche Mindeststichprobengröße wurde aus den mittleren p-Werten berechnet, indem das Signifikanzniveau auf p \(\le \) 0,05 gesetzt wurde.

Die Klonselektion erfolgte auf der Grundlage des Signal-Hintergrund-Verhältnisses (S/B) des Screening-Immunoassays, indem das zeitaufgelöste Fluoreszenzsignal jedes Klons durch das mittlere Signal von leeren Kontrollen derselben Screening-Platte dividiert wurde. Es wurden sowohl blinde als auch genotypgestützte Selektionen von Kandidatenklonen aus jeder gescreenten Bibliothek durchgeführt und verglichen. Der Genotyp für jeden Klon wurde als einzigartige Kombination von VH- und VL-Sequenzen definiert, mit Ausnahme der Anti-NS1-Bibliothek, wo jeder Klon nur eine Mutation an der angegebenen Position von CDRH2 oder CDRH3 aufwies. Bei der Blindselektion wurden die Klone mit Ausnahme der bekannten Kontrollvertiefungen auf der Grundlage des S/B-Verhältnisses eingestuft und die besten 10 oder 20 Klone ausgewählt und die Anzahl der einzigartigen Genotypen gezählt. Bei der genotypgestützten Selektion wurden die Daten des funktionellen Immunoassays nach Genotyp gruppiert und die Selektionen auf der Grundlage des maximalen S/B aus jeder Genotypgruppe durchgeführt. Für die retrospektive Bewertung der Bibliotheksqualität wurden die Anzahl einzigartiger Genotypen und die Anzahl der Klone innerhalb der Gruppen berechnet. Für Anti-NS1-Bibliotheken wurde die Anzahl einzigartiger Aminosäurereste in jeder mutierten Position berechnet. Zum Vergleich wurden auch leistungsschwache Genotypen aus der Anti-NS1-Bibliothek ausgewählt. Genotypen mit mehr als drei Klonen und einem statistisch signifikanten Unterschied im Screening-Assay S/B (p < 0,05, zweiseitiger Mann-Whitney-U-Test) im Vergleich zu den Eltern wurden als Kandidaten für den EC\(_{50}\)-Assay in Betracht gezogen.

EC\(_{50}\) TRF-Immunoassays wurden auf GAH-Platten durchgeführt (siehe ergänzende Materialien). Alle Inkubationen wurden bei Raumtemperatur unter langsamem Schütteln durchgeführt. Kurz gesagt, geklärte Lysate aus 5-ml-Expressionskulturen (hochskaliert von der 96-Well-Plattenexpression) wurden 1:5 (Anti-NS1) oder 1:10 (Anti-DARPin) auf AB verdünnt und 100 μl hinzugefügt zu jedem Brunnen. Die Platten wurden 1 Stunde lang inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 100 μl biotinyliertem Antigen in dreifacher Ausführung, mit Ausnahme der beiden stärksten Konzentrationen, für die nur eine Vertiefung verwendet wurde. Verdünnungen von 1000, 500, 50, 25, 5, 1, 0,1, 0,01 und 0,001 ng/ml von bio-DENV2-NS1 und 10.000, 2000, 1000, 500, 250, 75, 10, 1 und 0,1 ng/ml in AB wurden für Anti-NS1- bzw. Anti-DARPin-Assays verwendet. Bei schwachen Anti-NS1-Bindern wurden zwei der niedrigsten Konzentrationen abgesenkt und die beiden stärksten dreifach angewendet. Nach der Antigenzugabe wurden die Platten 2 Stunden lang inkubiert, gefolgt von zwei Wäschen und der Zugabe von 100 µl gefiltertem 100 ng/ml SA-Eu. Nach 15 Minuten Inkubationszeit wurden die Vertiefungen zweimal gewaschen und 200 μl Delfia-Verstärkungslösung hinzugefügt. Schließlich wurde das TRF-Signal nach 10-minütiger Inkubation mit dem Victor 1420 Multilabel Counter gemessen.

Die während der aktuellen Studie generierten und analysierten NGS-Rohdaten sind im Sequence Read Archive (SRA) unter der Zugangsnummer PRJNA951910 verfügbar. Daten zu Anti-Dengue-NS1-Bindern sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Studie wurde von der University of Turku Graduate School (UTUGS), Business Finland (Grant No. 2448/31/2018) und dem InFLAMES Flagship Program der Academy of Finland (Entscheidungsnummer: 337530) finanziert. Die Autoren danken dem finnischen Zentrum für funktionelle Genomik, das von der Universität Turku, der Universität Åbo Akademi und dem Biocenter Finnland unterstützt wird, für den MiSeq-Sequenzierungsdienst. Abschließend möchten sie Dr. Stuart Prince unseren aufrichtigen Dank für sein sorgfältiges Korrekturlesen des Manuskripts und sein unschätzbares Feedback zur Verbesserung der Klarheit und Qualität des Textes aussprechen.

Abteilung für Biowissenschaften, Universität Turku, 20520, Turku, Finnland

Sami Oksanen, Roope Saarinen, Anttoni Korkiakoski, Urpo Lamminmäki und Tuomas Huovinen

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SO führte die Experimente durch, analysierte die Daten und schrieb den Artikel. TH und SO entwarfen die Indexierungsstrategie und Primer und planten die Experimente. TH und UL überprüften das Manuskript und gaben Hinweise zur Verbesserung. AK und RS halfen beim funktionellen Screening der löslichen Anti-DARPin- bzw. Anti-NS1-Fabs.

Korrespondenz mit Sami Oksanen oder Tuomas Huovinen.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Oksanen, S., Saarinen, R., Korkiakoski, A. et al. Das genotypisierte funktionelle Screening löslicher Fab-Klone ermöglicht eine detaillierte Analyse der Mutationseffekte. Sci Rep 13, 13107 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40241-2

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Eingegangen: 4. April 2023

Angenommen: 07. August 2023

Veröffentlicht: 11. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40241-2

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