Entwicklungsgenetische Grundlagen einer Symbiose

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 14014 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Gegenseitige Interaktionen zwischen Organismen vermitteln häufig die Innovation von Merkmalen, die für die Aufrechterhaltung der Beziehung unerlässlich sind. Unser Verständnis dieser Wechselwirkungen wurde jedoch durch verschiedene Hürden bei der Untersuchung der Genetik von Nicht-Modelltieren behindert. Um die genetischen Mechanismen zu verstehen, durch die sich solche Merkmale entwickeln, untersuchten wir die Funktion der Gene atemlos (btl), trachealos (trh) und doppelgeschlechtlich bei der Entwicklung eines neuartigen pilztragenden Organs (Mykangium), das eine obligate Beziehung zwischen Pilz- Zucht von Ambrosiakäfern und bestimmten Pilzpartnern. Der Gen-Knockdown durch RNA-Interferenz und die anschließende Visualisierung mittels Mikrocomputertomographie lassen darauf schließen, dass BTL und TRH für die Auslösung von Mykangien erforderlich sind und dass die Tubulogenese möglicherweise für die frühe Entwicklung von Mykangien genutzt wurde.

Die evolutionäre Entwicklungsbiologie versucht, grundlegende Fragen zu den Mechanismen zu beantworten, die der morphologischen Innovation und Evolution hin zu zunehmender struktureller Komplexität innerhalb des Körperplans zugrunde liegen. Die Kooptation ermöglicht die Wiederverwendung zentraler Entwicklungsgene in einem neuartigen Entwicklungskontext, beispielsweise die Integration von Insektenanhangsgenen in die Entwicklung von Schmetterlingsaugenflecken1. Unter vielen interessanten Beispielen sind neuartige Merkmale von besonderer Relevanz, die bei der Aufteilung eines mikrobiellen Symbionten im tierischen Wirtskörper helfen können. Der Hawaiianische Bobtail-Tintenfisch (Euprymna scolopes) und sein Symbiont Vibrio fischeri sind ein solches Konsortium, bei dem die Identifizierung kooptierter Genziele im Lichtorgan des Tintenfischs dazu beigetragen hat, die Identität und die evolutionären Ursprünge dieser Struktur zu entschlüsseln2.

Ambrosiakäfer, die mehr als 3500 Arten unter den Echten Rüsselkäfern (Curclionidae) umfassen, haben über ein Dutzend Mal unabhängig voneinander obligate Nahrungspartnerschaften mit Pilzen geschlossen3. Ihre Fähigkeit, Pilzsymbionten innerhalb spezialisierter Organe, Mycangia genannt, zu übertragen, hat zu zahlreichen Untersuchungen zur Morphologie und Funktion geführt. Außerhalb der phylogenetischen Forschung liefern jedoch nur wenige Studien molekulargenetische Ressourcen4,5, und die genetischen und entwicklungsbedingten Mechanismen, die der wiederholten Evolution von Mycangia zugrunde liegen, sind noch immer kaum verstanden. Mycangia kann in einer Vielzahl von Körpersegmenten mit unterschiedlichem Komplexitätsgrad gefunden werden; Einige Mykangien treten als flache Grübchen auf, während es sich bei anderen um kompliziertere Einstülpungen, Taschen oder Röhrchen handelt3,6. Diese strukturelle Anpassung ist mit einer Verschiebung sowohl der Nahrungszusammensetzung der Larven als auch der Struktur der Geburtsgalerie in Gehölzumgebungen im Vergleich zu ihren Phloem fressenden Borkenkäfer-Verwandten verbunden7. Daher ist die Xylomycetophagie für die ökologische Nische, die durch Ambrosiakäfer und ihre Pilzsymbiosen definiert wird, von wesentlicher Bedeutung7. Diese Entwicklung zur Xylomycetophagie fand zwischen einer großen Vielfalt von Pilzpartnern statt6; Unterschiedliche Ernährungsassoziationen, die zum gleichen strukturellen und funktionellen Endpunkt führen, lassen darauf schließen, dass diese engen Ernährungsbeziehungen die spezialisierte Entwicklung innerhalb des Wirtsinsekts vorantreiben können.

Das relativ abgeleitete Merkmal der Pilzkultivierung hat es den Käfern ermöglicht, in nährstoffarmen Holzlebensräumen zu gedeihen, indem es ihnen ermöglicht hat, Lignozellulose als wertvolle Ressource zu nutzen. Während ihr holzbohrendes Verhalten in erster Linie auf gestresste oder absterbende Bäume abzielt, können die ausgedehnten Angriffe auf Wirtsbäume ihren Niedergang verschlimmern. In der heutigen globalisierten Welt erhöht die Einführung exotischer Ambrosiakäferarten die Wahrscheinlichkeit neuartiger Interaktionen mit einheimischen Bäumen und erhöht dadurch das Potenzial für die Entstehung neuer Wirtsgemeinschaften. Infolgedessen haben sich Ambrosiakäfer zu einem wichtigen Thema in den Bereichen Waldpathologie und Entomologie entwickelt. Darüber hinaus macht die Vielfalt der Mycangia-Morphologie und der symbiotischen Beziehungen mit Pilzpartnern sie aus Evo-Devo-Perspektive äußerst interessant. Hier verwendeten wir die Ambrosiakäferart Euwallacea validus, um die genetischen Grundlagen der Mycangia-Entwicklung zu untersuchen. Diese Art, die Ende des 20. Jahrhunderts in die USA eingeführt wurde, ist im Nordosten der USA weit verbreitet. Erwachsene weibliche E. validus übertragen ihren primären Nahrungssymbionten, Fusarium oligoseptatum, vermutlich in ein Paar präoraler Mykangien, die sich medial im Kopf hinter den Mandibeln befinden. Frühere Untersuchungen zur inneren Organisation der Mykangie identifizierten ein zweites Paar kleiner Beutel im Kopf, die unterhalb der primären Mykangie liegen und sich seitlich in der Nähe jedes Auges befinden, erstreckten sich jedoch nicht auf eine funktionelle Charakterisierung8. Es ist auch bekannt, dass Euwallacea-Arten sekundäre Symbionten übertragen (z. B. Raffaelea subfusca und Graphium sp.), von denen angenommen wird, dass sie im Laufe der Entwicklung abwechselnde Rollen in Geburtsgalerien spielen9. Es wurde festgestellt, dass andere Ambrosiakäferarten nicht nur multiple Mykangien entwickeln, sondern möglicherweise auch verschiedene Symbionten in getrennten Beuteln unterbringen6. Die Auflösung der Euwallacea-Gattung lässt viele Fragen zu peripheren Partnerschaften unbeantwortet, hat jedoch eine hochpräzise Beziehung zwischen diesen Käfern und Fusarium gezeigt. Die Untersuchung und kulturbasierte Probenahme von 250 weiblichen E. validus führte zur Erholung von Pilzen bei 99,2 % der beprobten Individuen, was auf eine robuste Konservierung von Mycangia und Pilzbesiedlung in Wildtyppopulationen hinweist10,11.

Unsere früheren Untersuchungen haben gezeigt, dass sich präorale Mykangien während des Puppenstadiums bei Euwallacea validus entwickeln8. Um frühe Kandidaten zu erkennen, die möglicherweise an der Entwicklung von Mykangien beteiligt sind, haben wir zwei Gene ausgewählt, Trachealess (trh) und Breathless (btl), basierend auf den Strukturmerkmalen der präoralen Mykangie und ihrem wiederholten Einsatz während der Tubulogenese während der Insektenentwicklung. Es wurde gezeigt, dass der Transkriptionsfaktor Trachealess (Trh) die Expression des Fibroblasten-Wachstumsfaktorrezeptors Breathless (Btl) während der Einleitung der Tubulogenese reguliert – einem Entwicklungsprozess, der sowohl bei der Speicheldrüsen- als auch bei der Trachealmorphogenese bei der Embryogenese von Drosophila zum Einsatz kommt12. Obwohl Mykangien nur bei Frauen funktionsfähig sind10, deuten unsere früheren Untersuchungen darauf hin, dass Männer eine Protomykangie entwickeln, ein potenzielles Äquivalent zu Mykangien, die in ihrer Größe reduziert sind und wahrscheinlich keine Funktion bei der Übertragung von Pilzvermehrungen haben13. Um die geschlechtsspezifische Regulation zu untersuchen, die an der Entwicklung dieser sexuell dimorphen Strukturen beteiligt ist, haben wir auch die Funktion des Gens doublesex (dsx) untersucht.

Wir haben ein RNA-Interferenz-vermitteltes Gen-Knockdown-System entwickelt, mit dem wir die Funktion von Kandidatengenen bei der Entwicklung von Mykangie untersuchen. Um das Genexpressionsniveau während der Mycangia-Entwicklung zu messen, verwendeten wir quantitative RT-PCR über den gesamten Lebenszyklus des weiblichen Käfers. Um den Phänotyp von RNAi-Tieren zu beobachten, verwendeten wir Mikrocomputertomographie (µCT)8. Diese Forschung liefert den ersten Bericht über genetische Beiträge bei der Entwicklung von Mycangia, einem Käferorgan, das für die Aufrechterhaltung der symbiotischen Beziehung von entscheidender Bedeutung ist.

Um zu untersuchen, ob Kandidatengene in Mycangia exprimiert werden und wie stark die unterschiedliche Expression zwischen Körpersegmenten ist, führten wir eine quantitative RT-PCR durch. Obwohl Mykangien bei anderen Arten aus den Brustsegmenten präpariert wurden (Xylosandrus germanus5), entwickeln sich die Mykangien bei E. validus innerhalb der harten Kopfkapsel. Darüber hinaus deutete unsere vorherige Studie darauf hin, dass ihre Mykangie komplex ist, weshalb wir in dieser Studie den gesamten Kopf verwendeten, um mögliche Verzerrungen während des Probenahmeprozesses zu vermeiden (Abb. 1a). Insgesamt zeigten unsere Ergebnisse, dass alle Kandidatengene in allen getesteten Stadien in Köpfen und Abdomen exprimiert wurden (Abb. 2). Unsere statistischen Analysen ergaben jedoch keinen Unterschied in den durchschnittlichen Expressionsniveaus der Kandidatengene zwischen Kopf (einschließlich Mykangie) und Bauch.

qPCR bei weiblichen E. validus-Käfern über die gesamte Entwicklung hinweg und zwischen Kopf- und Bauchgewebe. (a) E. validus-Gewebepräparationen, gesammelt für Kopf- (lila) und Bauchgewebeproben (gelb), analysiert in qRT-PCR. (b) −ΔCt-Wert für Kopf- und Bauchgewebe im gesamten Lebensstadium. Die Ergebnisse zwischen den Geweben unterschieden sich nicht signifikant (siehe Ergänzungstabelle S1 für p-Werte).

Die Morphologie von Mycangia in E. validus. (a) Transversales µCT-Bild, das das große, mediale Mycangia-Paar zeigt. Einer von Mycangia ist rot schattiert (rote Pfeilspitze). (b) Transversales µCT-Bild, das das kleinere (untere) Paar mycangia-ähnlicher Beutel zeigt. Eine der Strukturen ist blau schattiert (blaue Pfeilspitze). (c) Ein äußeres Bild einer frühgeborenen erwachsenen Frau korreliert die äußere Morphologie mit der Ebene des digitalen Querschnitts. Linien geben die Querschnittsebene in a (rot) und b (blau) an.

Unsere frühere morphologische Studie legte nahe, dass E. validus komplexe, möglicherweise zweipaarige Mykangien beherbergt, ein Hauptpaar im eher vorderen und medialen Kopf und ein Nebenpaar im unteren (ventralen) lateralen Teil des Kopfes (Abb. 2)8 . Um die Funktion von Kandidatengenen zu untersuchen, haben wir ein Protokoll für Larven-RNAi erstellt. Insgesamt beeinflusste die RNAi-Behandlung die Entwicklung des Hauptpaares von Mykangien, die Morphologie der Nebenmykangien wurde jedoch möglicherweise nicht beeinträchtigt (Abb. 3). Bei mit btl-dsRNA behandelten Tieren fehlten Mykangien bei 3 von 6 Individuen. Bei Tieren, denen trh-dsRNA injiziert wurde, fehlten bei 3 von 6 Tieren Mykangien. Von den Tieren, die im Rahmen der Behandlung mit btl-dsRNA und trh-dsRNA Mykangie entwickelten, schien das Gesamtvolumen bei 2 Individuen reduziert zu sein (Abb. 4). In Fällen, in denen die Struktur fehlte, gab es keine klare Grenze oder leere Lücke, in der sich Mykangie entwickelt hätte (Abb. 3f und h); Mycangialmembranen waren in keinem Winkel oder durch Änderung des Kontrasts erkennbar, obwohl deutlich andere gefärbte Weichteile im Kopf, wie z. B. Muskelfasern, vorhanden waren. Mikro-CT-Ergebnisse deuten darauf hin, dass alle Weibchen, denen im Larvenstadium dsx-dsRNA injiziert wurde, im Erwachsenenalter eine Mykangie entwickelten (7 von 7 Weibchen, Abb. 3b und c). Die Negativkontrolle war nicht von unbehandelten Wildtyp-Tieren zu unterscheiden.

Repräsentative RNA-Interferenz-Phänotypen. (a) Ebenen der virtuellen Dissektion für obere (rote Linie entsprechend den Ergebnissen b, d, f, h) und untere (blaue Linie entspricht den Ergebnissen c, e, g, i) Querschnitte. Mikro-CT-Scans zeigen intakte obere Mycangia (roter Pfeil) bei den Kontrollinsekten (b) und dsx-dsRNA-behandelten Insekten, aber keine äquivalenten Strukturen bei den mit btl-dsRNA (f) oder trh-dsRNA (h) behandelten Tieren. Minderwertige Mycangia-ähnliche Räume (unten; blauer Pfeil) sind bei den Behandlungen Negativkontrolle (c), dsx-dsRNA (e), btl-dsRNA (g) und trh-dsRNA (i) sichtbar. Minderwertige Mykangien wurden bei keiner Behandlung gestört.

Repräsentativer Phänotyp von intaktem, aber reduziertem E. validus mycangia nach trh-dsRNA-Behandlung. Mycangia in der Negativkontrolle (a und b) wird durch die Behandlung nicht beeinträchtigt, während mit trh-dsRNA behandelte Personen (c und d) eine unregelmäßige Morphologie aufweisen. Rote Pfeile kennzeichnen Mykangie in jedem digitalen Querschnitt.

Aufgrund spezifischer Beziehungen kann die Entwicklung einer Symbiose mit der Entwicklung einzigartiger Merkmale sowohl bei Wirten als auch bei Symbionten verbunden sein2,14,15. Hier verwendeten wir eine Ambrosiakäferart E. validus, um die entwicklungsgenetischen Grundlagen spezialisierter, mit Symbiose verbundener Organe, bekannt als Mycangia, zu untersuchen. Wir haben uns auf zwei Entwicklungsprozesse konzentriert, die Tubulogenese und die Geschlechtsbestimmung, basierend auf morphologischen Beobachtungen und früheren Untersuchungen, die darauf hindeuteten, dass Mykangien nur bei Frauen funktionsfähig sind8,10,12. Ergebnisse quantitativer RT-PCR und RNAi legen nahe, dass Zielgene zumindest teilweise für die Entwicklung von Mykangie verantwortlich sind. Im Folgenden diskutieren wir weiter die potenzielle Bedeutung dieser Zielgene.

Wenn ein Gen eine entscheidende Rolle bei der Organogenese spielt, wird erwartet, dass die Genexpression während des relevanten Entwicklungszeitzeitraums hochreguliert wird. Unsere quantitativen RT-PCR-Ergebnisse zeigten jedoch keinen signifikanten Anstieg der Expression von trh und btl zwischen den Lebensstadien. Dies legt nahe, dass diese Gene während des gesamten Lebenszyklus des Käfers funktionell exprimiert werden. Tatsächlich wird bei Drosophila die trh-Expression in Trachealzellen konstitutiv aufrechterhalten, selbst nachdem die Trachealentwicklung eingeleitet wurde 16, 17, 18. Alternativ könnte eine mögliche Variabilität bei der Bestimmung des Stadiums die hohe Variabilität der ΔCT-Werte beeinflusst haben (siehe Ergänzungstabelle S1 für p-Werte). Wir haben Puppen und erwachsene Tiere anhand ihrer Körperfarbe (Anzeichen der Sklerotisierung) in Stadien eingeteilt. Die Einstufung von Tieren nach Zeitpunkt (z. B. Tage nach der Häutung) kann jedoch die Auflösung von Genexpressionsmusteranalysen erhöhen.

Obwohl der Effekt bis zu 50 % betrug (3 von 6 Tieren zeigten sowohl bei der trh- als auch bei der btl-dsRNA-Behandlung den gleichen Phänotyp ohne Mykangie), erzeugte unsere RNAi-Methode eine Untergruppe von Tieren mit deutlich missgebildeter Mykangie bei Behandlungen im Zusammenhang mit Tubulogenese-Genen. Darüber hinaus zeigten einige Tiere nach der Behandlung eine verringerte Mykangiegröße. Zusammen mit den qPCR-Ergebnissen schlagen wir vor, dass die Gene trh und btl für die Einleitung der Mycangia-Entwicklung in E. validus verantwortlich sind. Die Erfolgsrate der Larven-RNAi-Behandlung kann aufgrund der Funktion des Zielgens oder der Unterschiede in der Larvenreife zum Zeitpunkt der Injektion variieren. Wie oben erläutert, kann die Funktion dieser Gene für das Überleben von Tieren von entscheidender Bedeutung sein. Daher kann ein früher Abbau zu einer frühen Sterblichkeit und einem verringerten Anteil überlebender, behandelter Erwachsener führen.

Die Integration von trh und btl in die Mykangia-Initiierung lässt darauf schließen, dass die Tubulogenese in die Entwicklung der präoralen Mykangie bei E. validus einbezogen wurde und dass Käfer im Gegensatz zur Knötchenbildung bei Hülsenfrüchten möglicherweise keinen Pilzsymbionten benötigen, um die Entwicklung der Mykangie auszulösen. Tatsächlich wird die unabhängige strukturelle Initiierung durch Beobachtungen der aposymbiotischen Entwicklung in der Ambrosiakäfergattung Xylosandrus gestützt19. Es ist erwähnenswert, dass diese Gene möglicherweise nur an der Entwicklung des großen Mycangia-Paars dieser Art beteiligt sind, was auch auf den unabhängigen Ursprung von Major- und Minor-Mycangia schließen lässt.

In der größeren Taxonomie der Ambrosiakäfer variiert die Geschlechtsspezifität der Merkmale zwischen den Käfergruppen. Bisher ging man davon aus, dass Mykangien bei Euwallacea spezifisch für Frauen sind, weshalb sich die Untersuchungen auf ein weibliches Modell konzentrierten13,20,21. dsx-dsRNA-injizierte Insekten zeigten im Erwachsenenstadium intakte Mykangien und Mykangien waren in allen Proben sichtbar (7 von 7, Abb. 3b). Bei Käfern, denen dsx-dsRNA injiziert wurde, blieb die Membran intakt, was darauf hindeutet, dass der Abbau von dsx den Beginn oder Abschluss der Mykangie nicht beeinträchtigte. Dies deutet darauf hin, dass die zuvor beobachteten morphologischen Unterschiede zwischen den Geschlechtern8 möglicherweise nicht so einfach sind wie bei Käferhörnern, bei denen dsx die geschlechtsspezifische Hornentwicklung reguliert22, sondern vielmehr auf andere Mechanismen wie Ploidie und die damit verbundenen Genexpressionsmuster zurückzuführen sind23,24.

Es hat sich gezeigt, dass die Kooptation bestehende Entwicklungsprogramme in die Entwicklung symbiosebedingter Neuheiten integriert. Bei Hülsenfrüchten wird ein lateraler Wurzeltranskriptionsfaktor in der Wurzelrinde eingesetzt, um Komponenten der lateralen Wurzelentwicklung für die Strukturierung von Knötchen zu kooptieren14,15. Im Lichtorgan des hawaiianischen Bobtail-Tintenfischs, Euprymna scolopes, wurden Augengene in die Entwicklung des auf Licht reagierenden Photophors einbezogen2. Dass Mycangia möglicherweise Teile bestehender Entwicklungspfade – wie etwa die Tubulogenese – nutzt, um die Entwicklung einzuleiten, steht im Einklang mit anderen Modellen für die Entwicklung neuer Strukturen. Diese Studie liefert das erste Beispiel für eine mögliche Kooptation von Genen, die für die Tubulogenese und die Entwicklung von Mykangie entscheidend sind. Informationen, die durch die Kategorisierung des neuartigen Genregulationsnetzwerks gewonnen werden, das für die Mykangenentwicklung in E. validus verantwortlich ist, könnten ein Modell liefern, das in zukünftigen Arbeiten mit anderen Arten über Kladen unterschiedlichen evolutionären Ursprungs hinweg getestet werden kann, um festzustellen, ob dieselben regulatorischen und strukturellen Gene kooperiert haben. entschied sich für die Musterung ähnlicher Strukturen.

Insekten wurden aus Ailanthus altissima-Stämmen gesammelt und im Labor gemäß den zuvor beschriebenen Protokollen aufgezogen8. Kurz gesagt: Erwachsene wurden mechanisch aus gespaltenen Stämmen extrahiert und dann in sterilisiertem Agarmedium, das A. altissima-Sägemehl enthielt, aufgezogen. Die Larven wurden auf Glucose-Hefeextrakt-Agarplatten (GYEA) mit vollständig besiedelten Fusarium oligoseptatum-Rasen als Nahrungsquelle übertragen. Die Puppen wurden in künstliche Galerien innerhalb von Sägemehl-Wasser-Agarplatten überführt und bis zum Abschluss ihrer endgültigen Häutung überwacht.

Die Tiere wurden in LN2 schockgefroren und zur vollständigen RNA-Extraktion mit Mörser und Pistill unter Verwendung des QIAgen RNeasy Plus Micro RNA-Extraktionskits zermahlen. Die Reverse Transkription wurde mit dem SuperScript IV Kit durchgeführt, um cDNA-Bibliotheken aus Gesamt-RNA zu generieren. Für die Gene von Interesse (dsx, btl, trh) wurden mRNA-Sequenzen aus der NCBI-Gendatenbank abgerufen, um degenerierte Primer aus Aminosäure-Konsensussequenzen zu entwerfen. Teilweise Gensequenzen wurden in der NCBI GenBank (OP948674-8) hinterlegt.

Herstellung von dsRNA wie von Kijimoto et al.22 beschrieben. Primer für jedes Kandidatengen (doublesex (dsx) (F: 5′-GAACTTGTTGTCCGTGCCTC-3′, R: 5′-GTACTAGTTGCCGGTGCAGC-3′), atemlos (btl) (F: 5′-CTTCCAGCAAACGCAGTG-3′, R: 5 ′-TGCGATCATTTTCTCCCGT-3′) und trachealess (trh) (F: 5′-AGGAAGTGGTTCATAAGAAA-3′, R: 5′-GTATTAAAACAACCCTATACC-3′)) wurden entwickelt, um ~ 150 bp-Regionen jedes Gens zu amplifizieren. 85–125 ng dsRNA wurden jeder Larve über 13,8-nL-Injektionen mit einer Nanoject-Mikropipette und gezogenen Glasnadeln zugeführt. Die Larven wurden in das erste Prothorakalsegment direkt hinter der Kopfkapsel injiziert. Injizierte Larven wurden auf GYEA-Platten mit vollständig besiedelten F. oligoseptatum-Rasen platziert, um sich zu erholen und zu reifen.

Das Scannen und Färben wurde wie von Spahr et al.8 beschrieben durchgeführt. Äußere Morphologie vor der Färbung mit einem Leica-Stereomikroskop fotografiert. Insgesamt 19 Insekten (6 trh-RNAi, 6 btl-RNAi und 7 dsx-RNAi) wurden gescannt und analysiert; Proben wurden von der Analyse ausgeschlossen, wenn Verfärbung, Okklusion, Scanqualität oder mechanische Beschädigung die Beobachtung an den relevanten Stellen im Kopf verhinderten.

Weibliche E. validus wurden im Puppen- und Erwachsenenstadium gesammelt und anhand äußerer Merkmale nach Reifegrad getrennt. Für jedes der sechs Lebensstadien wurden fünfzehn Insekten gesammelt. Fünf Insekten wurden zu einer einzigen biologischen Probe zusammengefasst, wobei für jedes Lebensstadium drei biologische Replikate verarbeitet wurden. Die Insekten wurden in Kopf- und Bauchabschnitte zerlegt (Abb. 1A), bevor sie sofort in LN2 schockgefrostet und bei -80 °C gelagert wurden. RNA wurde mit dem RNeasy Plus Micro Kit von Qiagen extrahiert und mit ThermoFisher SuperScript IV VILO Master Mix zu cDNA synthetisiert; Die reverse Transkription wurde mit 200 ng RNA durchgeführt. Die Probenreinheit wurde durch Nanodrop-Absorptionsverhältnisse und Gelelektrophorese beurteilt. Eine mögliche gDNA-Kontamination wurde durch gDNA-Eliminatorsäulen während der RNA-Extraktion und ezDNase-Behandlung während der reversen Transkription eliminiert. qPCR wurde unter Verwendung des PowerTrack SYBR Green-Protokolls mit dem Echtzeit-PCR-Maschinenvergleichsprogramm QuantStudio 3 (Applied Biosystems) (QuantStudio v.1.5.0) unter Verwendung mehrerer endogener Reporter und des passiven ROX-Referenzsignals durchgeführt. Die Expression der Zielgene (dsx, btl, trh) wurde auf zwei endogene Referenzgene standardisiert, die ribosomale Proteinuntereinheit 3 (rps3) und den Elongationsfaktor 1 alpha (ef1a) (Abb. 1B). qPCR-Reaktionen wurden mit einem Reaktionsvolumen von 20 μl gemäß dem PowerTrack SYBR Green-Protokoll mit 1 μl cDNA pro Reaktion (entsprechend entweder 5 ng oder 10 ng äquivalenter Ausgangs-RNA nach Geschlecht) vorbereitet. Primersätze für Zielgene doublesex (dsx) (F: 5′-GAACTTGTTGTCCGTGCCTC-3′, R: 5′-GTACTAGTTGCCGGTGCAGC-3′), atemlos (btl) (F: 5′-CTTCCAGCAAACGCAGTG-3′, R: 5′ -TGCGATCATTTTCTCCCGT-3′) und trachealess (trh) (F: 5′-ACTCCAAAAATGCCGAAGAA-3′, R: 5′-TTTCTGGGTCATTACTGCTG-3′) und endogene Reporter ribosomale Proteinuntereinheit 3 (rps3) (F: 5′-ATTGTGCGCTATTGCCCAAG -3′, R: 5′-TGTCCTCTCAATTTGCCCGA-3′) und Elongationsfaktor 1 Alpha (ef1a) (F: 5′-ACCATCATTGATGCCCCTGG-5′, R: 5′-AGCATGCTCTCTGGTCTGTC-3′) wurden entwickelt, um 150 Basen zu amplifizieren eine Glühtemperatur von 54 °C und wurden in jeder Reaktion in einer Endkonzentration von 400 nM einbezogen. Die Robustheit und Spezifität der Primer wurde vor der Analyse in PCR-Verdünnungsreihen getestet. Quantitative RT-PCR wurde mit den folgenden Zyklusparametern durchgeführt: 2 Minuten bei 95 °C, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 15 Sekunden, 54 °C für 15 Sekunden und 72 °C für 30 Sekunden, dann 95 °C für 15 s. Während Stufe 3 wurde eine Schmelzkurve von 54 bis 95 °C mit Kameraaufnahme erstellt. Biologische Replikate wurden in dreifacher Ausfertigung bewertet, mit drei technischen Replikaten pro Probe. Die Genexpression wurde auf die endogenen Reporter für ΔCt-Werte standardisiert und bei der Berechnung der ΔΔCt-Werte für jedes Lebensstadium auf Bauchgewebe normalisiert. Ein Wilcoxon-Signed-Rank-Test wurde verwendet, um die Signifikanz der ΔCt-Werte zwischen Geweben nach Gen und Stadium zu testen.

Zugehörige Sequenzdaten finden Sie in der NCBI GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) unter Accessions [OP948674 bis OP948678]. Die während dieser Studie generierten Sequenzdatensätze sind im Zusatzmaterial verfügbar.

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Referenzen herunterladen

Wir möchten Karen Martin und Sarah McLaughlin von der WVU Animal Models Imaging Facility für die Nutzung des Bruker Skyscan 1272 Micro-CT und der dazugehörigen Software danken. Zwei anonyme Gutachter lieferten konstruktive und aufschlussreiche Kommentare. Diese Forschung wurde durch Mittel des USDA-NIFA (HATCH) WVA00712 unterstützt.

Abteilung für Pflanzen- und Bodenwissenschaften, West Virginia University, Morgantown, WV, USA

Ellie J. Spahr, Fady Wasef, Matt T. Kasson und Teiya Kijimoto

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ES und TK konzipierten Forschung; ES und FW führten Experimente durch; ES und TK analysierten Daten; ES, MK und TK haben den Artikel geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Teiya Kijimoto.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Spahr, EJ, Wasef, F, Kasson, MT et al. Entwicklungsgenetische Grundlagen eines Symbiose-assoziierten Organs im pilzzüchtenden Ambrosiakäfer Euwallacea validus. Sci Rep 13, 14014 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40296-1

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Eingegangen: 07. November 2022

Angenommen: 08. August 2023

Veröffentlicht: 28. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40296-1

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